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Alle Eingriffe mit menschlichen Teilnehmern wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für das Wohlergehen des Menschen durchgeführt und vom lokalen institutionellen Prüfungsausschuss überprüft.
>1. CIK-Induktion und -Expansion
- An Tag 0 werden die PBMCs (1 x 106) in frischem Basalmedium mit 1.000 I.E./ml IFN-γ 24 h lang in einem befeuchteten Zellkultur-Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2 kultiviert.
- An Tag 1 wird das Medium mit frischem Basalmedium aufgefrischt, das 50 ng/ml Anti-CD3-Antikörper, 1 ng/ml rh IL-1α und 1.000 U/ml rh IL-2 enthält. Frischen Sie das Medium alle 3 Tage auf.
- An Tag 7 wird das Medium mit frischem Basalmedium aufgefrischt, das 1.000 U/ml rh IL-2 enthält. Frischen Sie das Medium alle 3 Tage bis zum Ende der Zellexpansion (Tag 14) auf.
>2. Immunphänotypisierung zur Beurteilung von CIK-Zellen
- Waschen Sie die CIK-Zellen mit 10 mL sterilem PBS. 10 min bei 300 x g und 18−20 °C zentrifugieren, den Überstand aspirieren und die Zellen mit 10 mL PBS resuspendieren. Zählen Sie die Zellzahl und testen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen mit dem Trypanblau-Ausschluss-Assay.
- Aliquotieren Sie die CIK-Zellen in sechs sterile 1,5-ml-Röhrchen mit einer Dichte von ~5–10 x 105 Zellen/ml PBS. Etikettieren und wie folgt behandeln: Röhrchen 1, Leerprobe (kein Antikörper); Röhrchen 2: 20 μl Isotyp IgG1-FITC zugeben; In Röhrchen 3 werden 20 μl mAbs des Isotyps IgG1-APC zugegeben; Röhrchen 4, fügen Sie 20 μl CD3-FITC hinzu; Röhrchen 5, fügen Sie 20 μl CD56-APC mAbs hinzu; und Röhrchen 6 fügen Sie 20 μl CD3-FITC und 20 μl CD56-APC mAbs hinzu.
- Mischen Sie die CIK-Zellen vorsichtig mit den Antikörpern, indem Sie sie mindestens 3x mit einer sterilen 1-ml-Pipette vorsichtig auf und ab pipettieren und dann 30 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.
- Die Röhrchen werden 10 min lang bei 300 x g und 18−20 °C zentrifugiert. Der Überstand wird abgesaugt und das Küvettenpellet einmal mit 1 mL PBS suspendiert. Pipettieren Sie sie mindestens 3x vorsichtig mit einer sterilen 1-ml-Pipette auf und ab.
- Wiederholen Sie Schritt 2.4.
- Lassen Sie die Röhrchen vor der durchflusszytometrischen Analyse im Dunkeln.
>3. Erkennung von CD-Markern
- Übertragen Sie die Zellsuspension in ein steriles 5-ml-Polystyrol-Rundbodenröhrchen mit einer Zellsiebkappe (100 μm Netz), indem Sie sie vorsichtig durch die Kappe pipettieren. Lege die Röhren der Reihe nach auf das Karussell.
- Öffnen Sie die Durchflusszytometrie-Analysesoftware und erstellen Sie einen experimentellen Ordner. Klicken Sie auf die Schaltfläche Neue Probe, um dem Experiment eine Probe und ein Röhrchen hinzuzufügen, und benennen Sie die Röhrchen wie folgt: Röhrchen 1, leer; Röhrchen 2, Isotyp IgG1-CD3; Röhrchen 3, Isotyp IgG1-CD56; Röhre 4, CD3; Röhre 5, CD56; Röhre 6, CD3CD56.
- Erstellen Sie ein Scatter-Gating-System für die CIK-Zellpopulationen (Abbildung 1A).
- Wählen Sie Röhre 1 (leer) und klicken Sie auf die Schaltfläche Punktdiagramm, um ein FSC-A/SSC-A-Diagramm zu erstellen. Zeichnen Sie ein rechteckiges Gate über die gesamte Zellpopulation mit einem FSC-A-Schwellenwert >5 x 104, um Zellablagerungen auszuschließen.
- Wählen Sie den Parameter SSC-A/SSC-H für das neue Punktdiagramm aus, und zeichnen Sie ein Polygon-Gate um alle einzelnen Zellen. Wählen Sie die Parameter Anzahl/FITC (CD3) bzw. Anzahl/APC (CD56) für das neue Histogrammdiagramm aus. Wählen Sie den Parameter FITC (CD3)/APC (CD56) für das neue Punktdiagramm aus, und zeichnen Sie ein Vier-Quadranten-Gate, um die vier Teilpopulationen zu definieren.
- Notieren Sie die Daten von 20.000 einzelnen Zellen in jeder Probe. Klicken Sie auf die Schaltfläche Stichprobe laden, um zuerst das leere Steuerelement zu analysieren. Identifizieren Sie die gesamte CIK-Zellpopulation mithilfe der Kanalparameter CD56 und CD3.
- Schritt 3.3 für die Untersuchung aller Proben wiederholen.
- Öffnen Sie die Dateien mit den statistischen Werten der einzelnen Probe, um CIK-Zellpopulationen zu analysieren, und drucken Sie sie in Analysedateien nach.
