CD-Markererkennung von humanen Zytokin-induzierten Killerzellen mittels Durchflusszytometrie

Zusammenfassung

Quelle: Hsiao, C. H., et al. Isolierung und Expansion von zytotoxischen Zytokin-induzierten Killer-T-Zellen für die Krebsbehandlung. J. Vis. Exp. (2020)

In diesem Video demonstrieren wir eine auf Durchflusszytometrie basierende Technik zur Bestimmung des Anteils von Zytokin-induzierten Killer-T-Zellen, CIK-Zellen, die aus einer mononukleären Zellkultur aus dem peripheren Blut expandiert wurden.

Protokoll

Alle Eingriffe mit menschlichen Teilnehmern wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für das Wohlergehen des Menschen durchgeführt und vom lokalen institutionellen Prüfungsausschuss überprüft.

>1. CIK-Induktion und -Expansion

1. An Tag 0 werden die PBMCs (1 x 10⁶) in frischem Basalmedium mit 1.000 I.E./ml IFN-γ 24 h lang in einem befeuchteten Zellkultur-Inkubator bei 37 °C und 5 % CO₂ kultiviert.
2. An Tag 1 wird das Medium mit frischem Basalmedium aufgefrischt, das 50 ng/ml Anti-CD3-Antikörper, 1 ng/ml rh IL-1α und 1.000 U/ml rh IL-2 enthält. Frischen Sie das Medium alle 3 Tage auf.
3. An Tag 7 wird das Medium mit frischem Basalmedium aufgefrischt, das 1.000 U/ml rh IL-2 enthält. Frischen Sie das Medium alle 3 Tage bis zum Ende der Zellexpansion (Tag 14) auf.

>2. Immunphänotypisierung zur Beurteilung von CIK-Zellen

1. Waschen Sie die CIK-Zellen mit 10 mL sterilem PBS. 10 min bei 300 x g und 18−20 °C zentrifugieren, den Überstand aspirieren und die Zellen mit 10 mL PBS resuspendieren. Zählen Sie die Zellzahl und testen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen mit dem Trypanblau-Ausschluss-Assay.
2. Aliquotieren Sie die CIK-Zellen in sechs sterile 1,5-ml-Röhrchen mit einer Dichte von ~5–10 x 10⁵ Zellen/ml PBS. Etikettieren und wie folgt behandeln: Röhrchen 1, Leerprobe (kein Antikörper); Röhrchen 2: 20 μl Isotyp IgG1-FITC zugeben; In Röhrchen 3 werden 20 μl mAbs des Isotyps IgG1-APC zugegeben; Röhrchen 4, fügen Sie 20 μl CD3-FITC hinzu; Röhrchen 5, fügen Sie 20 μl CD56-APC mAbs hinzu; und Röhrchen 6 fügen Sie 20 μl CD3-FITC und 20 μl CD56-APC mAbs hinzu.
3. Mischen Sie die CIK-Zellen vorsichtig mit den Antikörpern, indem Sie sie mindestens 3x mit einer sterilen 1-ml-Pipette vorsichtig auf und ab pipettieren und dann 30 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.
4. Die Röhrchen werden 10 min lang bei 300 x g und 18−20 °C zentrifugiert. Der Überstand wird abgesaugt und das Küvettenpellet einmal mit 1 mL PBS suspendiert. Pipettieren Sie sie mindestens 3x vorsichtig mit einer sterilen 1-ml-Pipette auf und ab.
5. Wiederholen Sie Schritt 2.4.
6. Lassen Sie die Röhrchen vor der durchflusszytometrischen Analyse im Dunkeln.

>3. Erkennung von CD-Markern

1. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein steriles 5-ml-Polystyrol-Rundbodenröhrchen mit einer Zellsiebkappe (100 μm Netz), indem Sie sie vorsichtig durch die Kappe pipettieren. Lege die Röhren der Reihe nach auf das Karussell.
2. Öffnen Sie die Durchflusszytometrie-Analysesoftware und erstellen Sie einen experimentellen Ordner. Klicken Sie auf die Schaltfläche Neue Probe, um dem Experiment eine Probe und ein Röhrchen hinzuzufügen, und benennen Sie die Röhrchen wie folgt: Röhrchen 1, leer; Röhrchen 2, Isotyp IgG1-CD3; Röhrchen 3, Isotyp IgG1-CD56; Röhre 4, CD3; Röhre 5, CD56; Röhre 6, CD3CD56.
3. Erstellen Sie ein Scatter-Gating-System für die CIK-Zellpopulationen (Abbildung 1A).
   1. Wählen Sie Röhre 1 (leer) und klicken Sie auf die Schaltfläche Punktdiagramm, um ein FSC-A/SSC-A-Diagramm zu erstellen. Zeichnen Sie ein rechteckiges Gate über die gesamte Zellpopulation mit einem FSC-A-Schwellenwert >5 x 10⁴, um Zellablagerungen auszuschließen.
   2. Wählen Sie den Parameter SSC-A/SSC-H für das neue Punktdiagramm aus, und zeichnen Sie ein Polygon-Gate um alle einzelnen Zellen. Wählen Sie die Parameter Anzahl/FITC (CD3) bzw. Anzahl/APC (CD56) für das neue Histogrammdiagramm aus. Wählen Sie den Parameter FITC (CD3)/APC (CD56) für das neue Punktdiagramm aus, und zeichnen Sie ein Vier-Quadranten-Gate, um die vier Teilpopulationen zu definieren.
   3. Notieren Sie die Daten von 20.000 einzelnen Zellen in jeder Probe. Klicken Sie auf die Schaltfläche Stichprobe laden, um zuerst das leere Steuerelement zu analysieren. Identifizieren Sie die gesamte CIK-Zellpopulation mithilfe der Kanalparameter CD56 und CD3.
4. Schritt 3.3 für die Untersuchung aller Proben wiederholen.
5. Öffnen Sie die Dateien mit den statistischen Werten der einzelnen Probe, um CIK-Zellpopulationen zu analysieren, und drucken Sie sie in Analysedateien nach.

Ergebnisse

Abbildung 1: Der Anteil der CD3⁺CD56⁺ T-Zellen aus einer repräsentativen PBMC-Probe.(A) Lymphozyten wurden anhand der spezifischen Größe und Granularität erkannt. Ausgewählte Einzelzellpopulation für die Analyse mittels Durchflusszytometrie. (B) Die statistische Analyse der Wirksamkeit der CIK-Expansion von drei gesunden Spendern wurde mit einem t-Test durchgeführt (*, p <...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
APC Mouse Anti-Human CD56 Antikörper	Bd	555518	Nr. B159
APC Maus IgG1, κ Isotyp-Steuerung	Bd	555751	MOPC-21
BD FACSCanto II Durchflusszytometer	Bd	338962	SN: R33896202856
Dulbecco's Modified Eagle Medium/F12	HyClone	SH30023.02	Basalmedium für OC-3-Zellkultur
Fötales Rinderserum	HyClone	SH30084.03	Für K562- und OC-3-Zellkulturen. Vollständiges Medium enthält 10 % FBS
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare Life Sciences	Artikel-Nr.: 71101700-EK	Lösung des Dichtegradienten
FITC Maus Anti-Human-CD3-Antikörper	Bd	555332	UCHT1
FITC Maus IgG1, κ Isotyp-Steuerung	Bd	555748	MOPC-21
Humane Anti-CD3 mAb	Takara	T210	OKT3 2,5 ml Stamm (1 mg/1 ml) zu 50 ml Induktionsmedium hinzufügen. Lagerbestand bei -80 °C
RPMI1640 mittel	Gibco	Artikel-Nr.: 11875-085	Basalmedium für die K562-Zellkultur. Lagerbestand bei 4 °C