Assay zur Identifizierung der Interferon-gamma-Sekretion in lymphatischen Organen der Maus

Zusammenfassung

Quelle: Mazet, J. M., et al. Bildgebung der In-situ-Interferon-Gamma-Produktion in der Milz der Maus nach einer Listeria monocytogenes-Infektion. J. Vis. Exp. (2019).

Dieses Video zeigt eine bildgebende Methode zur Visualisierung der in situ Interferon-gamma (IFN-γ) Sekretion in der Milz der Maus. Nach einer bakteriellen Infektion und der Induktion der IFN-γ-Akkumulation in T-Zellen und natürlichen Killerzellen wird die Milz aus der Maus entnommen. Nach der Entnahme von Gewebeschnitten wird eine Immunfärbung durchgeführt, um IFN-γ in den Zellen sichtbar zu machen.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Adoptiver Transfer von antigenspezifischen CD8+ T-Zellen bei Mäusen

1. Isolierung von Ovalbumin (OVA)-spezifischen CD8⁺ T-Zellen (OTI), die grün fluoreszierendes Protein (OTI-GFP) oder rot fluoreszierendes Protein (OTI-RFP) exprimieren, aus der Lymphknotensuspension von T-Zell-Rezeptor-transgenen Mäusen unter Verwendung eines CD8⁺ T-Zell-Isolationskits der Maus gemäß den Herstellungsanweisungen. Bereiten Sie die Zellsuspension vor, indem Sie die Lymphknoten mit einem Spritzenkolben zerschlagen, wie zuvor beschrieben.
2. Übertragen Sie OTI-GFP- oder OTI-RFP-Zellen (3 x 10,⁶ Zellen) durch intravenöse Injektion in C57BL/6-Wildtyp-Mäuse, wie von Cahalan et al. beschrieben. Verwenden Sie Mäuse, die typischerweise 6–12 Wochen alt sind.
   Anmerkung: Dieser Schritt ist optional und nur für die Verfolgung von antigenspezifischen CD8⁺ T-Zellen erforderlich.

>2. Listeria monocytogenes Infektion

1. Expandieren Sie L. monocytogenes, genetisch verändert, um OVA (LM-OVA) zu exprimieren, bis zu einer exponentiellen Wachstumsphase in Brühe-Herzinfusion bei 37 °C unter sanfter Bewegung, bis der OD600 0,08–0,1 erreicht, wie zuvor beschrieben.
2. Injizieren Sie 100 μl (maximales Volumen = 200 μl) 0,1–0,5 LD50 LM-OVA, verdünnt in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), durch intravenöse Injektion mit einer 29-G-Insulinspritze in C57BL/6-Wildtyp-Mäuse, die OTI-GFP- oder OTI-RFP-Zellen tragen, wenn dies angezeigt ist.
   Anmerkung: In unseren Händen entsprechen 0,1 x LD50 LM-OVA 2 x 10⁴ koloniebildenden Einheiten (KBE). L. monocytogenes, genetisch modifiziert, um OVA zu exprimieren, wird verwendet, um die zuvor übertragenen OTI CD8⁺ T-Zellen zu aktivieren, aber auch andere Stämme von L. monocytogenes können verwendet werden.

>3. Behandlung mit Brefeldin A (BFA) zur Blockierung der Zytokinsekretion

1. 250 μg BFA in 200 μl PBS intraperitoneal für 6 h injizieren, bevor die Maus mit einer 29 G Insulinspritze getötet wird.
   Anmerkung: Lyophilisiertes BFA wird zunächst in Dimethylsulfoxid (DMSO) resuspendiert, um einen Bestand von 25 mg/ml Konzentration herzustellen. Das BFA wird dann bei Raumtemperatur (RT) in PBS verdünnt, um eine Kristallisation vor der Injektion zu vermeiden. Die Hemmung der Zytokinsekretion induziert die Akkumulation von IFNγ in den Zellen. Dies ist entscheidend für den Nachweis von Zytokinen.

>4. Die Milz ernten

1. Euthanasieren Sie die Mäuse mit steigenden CO₂ -Konzentrationen, gefolgt von einer Gebärmutterhalsluxation.
   Anmerkung: Befolgen Sie die Richtlinien der örtlichen Institution für die humane Euthanasie von Mäusen.
2. Reinigen Sie den Bauch mit 70% Ethanol und machen Sie einen Schnitt mit einer Schere, um einen 1-2 cm langen Schnitt durch die Haut an der linken Flanke der Maus zu machen, wo sich die Milz befindet. Machen Sie vorsichtig einen Schnitt im Bauchfell, um die Milz freizulegen, und nehmen Sie sie mit einer Pinzette heraus. Entnehmen Sie die Milz und achten Sie darauf, sie nicht mit einer Pinzette zu quetschen oder zu schneiden, um die Milzarchitektur nicht zu stören.

>5. Fixierung der Milz mit Paraformaldehyd (PFA)

1. Bereiten Sie die Fixierlösung vor, indem Sie 3,75 ml PBS und 3,75 ml 0,2 m L-Lysin mischen. 21 mg Natrium-m-Periodat zugeben und gut mischen. Fügen Sie dann 2,5 mL 4% PFA und 20 μL 12 N NaOH.
   hinzu Anmerkung: Verwenden Sie die Fixierlösung am selben Tag und entsorgen Sie den Überschuss. Lagern Sie es nicht. Dieser Fixierungsschritt ist wichtig, wenn die Probe fluoreszierende Proteine wie GFP enthält. Verwenden Sie kein PFA, das Spuren von Methanol enthält, da es fluoreszierende Proteine denaturiert.
   Vorsicht: PFA ist giftig und muss mit Vorsicht gehandhabt werden.
2. Tauchen Sie die Milz in das Fixiermittel und fixieren Sie sie mindestens 4 Stunden lang, typischerweise 16–20 Stunden bei 4 °C unter sanftem Rühren.
3. Verwerfen Sie die Fixierlösung und fügen Sie 5 ml PBS für 5 Minuten bei RT unter leichtem Rühren hinzu.
4. Das PBS durch 5 mL frisches PBS ersetzen und 1 h bei 4 °C unter leichtem Rühren inkubieren.
5. Ersetzen Sie das PBS durch 5 ml 30%ige Saccharose und inkubieren Sie es für 12–24 h.
   Anmerkung: Diese Methode hilft, die Gewebemorphologie zu erhalten. Nach der Inkubation mit Saccharoselösung sollte das Organ am Boden der Vertiefung absinken.

>6. Einfrieren und Schneiden

1. Geben Sie Trockeneis in einen großen Behälter und stellen Sie einen kleineren Behälter mit etwa 50 ml reinem Methanol und einigen Stücken Trockeneis hinein.
2. Trocknen Sie die Milz vorsichtig mit einem fusselfreien Tuch ab.
3. Legen Sie die Milz in eine Grundform, die unten einen Tropfen Optimum Cutting Temperature (OCT) enthält. Achte darauf, dass du keine Blasen produzierst. OCT über die Milz geben.
4. Legen Sie die Basisform mit einer Pinzette auf die Oberfläche des Methanols und achten Sie darauf, dass sie das OCT nicht berührt. Frieren Sie das Gewebe so schnell wie möglich ein, um Artefakte zu minimieren.
5. Wenn es eingefroren ist, fahren Sie mit dem Schneiden fort.
   Anmerkung: Gefrorene Milz kann mehrere Monate bei -80 °C aufbewahrt werden.
6. Schneiden Sie das Gewebe mit einem Kryo-Mikrotom.
   1. Stellen Sie die Kammertemperatur am Kryostaten auf -21 °C ein. Schneiden Sie Abschnitte mit der gewünschten Dicke (in der Regel ca. 10 μm). Dieses Protokoll funktioniert mit Dicken bis zu 30 μm.
7. Sammeln Sie Schnitte auf Objektträgern aus Glas (siehe Materialtabelle) und untersuchen Sie sie visuell.
   Anmerkung: Die Schnitte können mehrere Monate bei -80 °C gelagert werden.

>7. Immunfluoreszenz-Färbung

1. Lassen Sie die Sektion zu RT kommen.
2. Zeichnen Sie mit einem Flüssigblocker (z.B. PAP Pen) einen Kreis um den Gewebeschnitt. Zeichnen Sie außerhalb des OCT, sonst klebt es nicht.
3. Nach dem Trocknen rehydrieren Sie die Probe, indem Sie PBS für 5 Min. auf den Gewebeschnitt legen
   Anmerkung: Das Volumen, das auf den Abschnitt gelegt wird, hängt von der Größe des Abschnitts ab. In der Regel verwenden wir 100–300 μL. Lassen Sie die Abschnitte nicht trocknen, sobald sie rehydriert sind.
4. Spülen Sie mindestens zweimal mit PBS, um sicherzustellen, dass der Abschnitt gut auf dem Objektträger haftet.
5. Fügen Sie dem Abschnitt eine Blockierungslösung hinzu, um die unspezifische Bindung von Antikörpern zu verringern.
   1. Bereiten Sie die Blockierungslösung wie folgt vor: PBS mit 0,1 % Triton X100, 2 % fötales Kälberserum (FCS), 2,5 μg/ml Fc-Rezeptorblocker (Anti-Maus-CD16/32). Fügen Sie dann 2–5 % normales Serum der Spezies jedes Sekundärantikörpers des Färbepanels hinzu.
      Anmerkung: Wenn die Antikörper direkt konjugiert/biotinyliert sind, fügen Sie 5 % normales Serum der Spezies jedes Primärantikörpers hinzu. Wenn ein Primärantikörper und einer der Sekundärantikörper von derselben Spezies stammen (z. B. Primärantikörper, der in Kaninchen gezüchtet wurde, und sekundärer Kaninchen-Anti-Ratte), verwenden Sie nicht die normale Serumspezies, da dies das Hintergrundsignal erhöht.
   2. Entfernen Sie das PBS vorsichtig durch Aspiration aus dem Schnitt und fügen Sie 100 μl der Blockierungslösung pro Probenschnitt hinzu. In einer abgedeckten Nasskammer für mindestens 1 h bei RT inkubieren.
6. Mit Primärantikörpern färben.
   1. Verdünnen Sie die Primärantikörper in der optimalen Konzentration in der Blockierungslösung. Der allgemeine Ausgangspunkt für die Antikörperkonzentration liegt bei 5 μg/ml, sollte aber für jeden Antikörper und jedes Gewebe optimiert werden.
      Anmerkung: Wenn die Antikörper direkt konjugiert sind, zentrifugieren Sie den Antikörpermix bei 17,135 x g (13.500 U/min) für 15 min bei 4 °C, bevor Sie ihn verwenden. Fluorophore können ausfällen. Dieser Schritt pelletiert die Ausfällungen und verhindert dadurch eine unspezifische Ablagerung der gefällten Antikörper auf dem Objektträger.
   2. Ersetzen Sie die Blockierungslösung durch die primäre Antikörpermischung für jede Probe.
   3. 4 h bei RT oder über Nacht (OVN) bei 4 °C in einer abgedeckten Nasskammer inkubieren.
7. Führen Sie den Waschvorgang durch.
   1. Bereiten Sie den Waschpuffer vor, indem Sie 2 % FCS zu PBS hinzufügen.
   2. Waschen Sie 4 Mal mit Waschpuffer: einmal schnell (ohne Inkubation), einmal für 10 Minuten und zwei Mal für 5 Minuten. Führen Sie dann eine abschließende Wäsche mit PBS für 5 Minuten durch.
8. Färbung mit Sekundärantikörpern.
   1. Verdünnen Sie die interessierenden Sekundärantikörper in der optimalen Konzentration in der Blockierungslösung. Zentrifugieren Sie die Mischung, wie für die Primärantikörper beschrieben.
   2. Entfernen Sie die endgültige Waschlösung. Geben Sie die sekundäre Antikörpermischung auf den Schnitt und inkubieren Sie sie 1–4 h lang bei RT in einer abgedeckten Nasskammer.
9. Waschen Sie 4 Mal mit Waschpuffer: einmal schnell (ohne Inkubation), einmal für 10 Minuten und zwei Mal für 5 Minuten. Führen Sie dann eine abschließende Wäsche mit PBS für 5 Minuten durch.
10. Entfernen Sie die endgültige Waschlösung. Lassen Sie das PBS verdunsten, aber trocknen Sie den Abschnitt nicht zu stark. Geben Sie einen Tropfen des Eindeckmediums auf die Probe und setzen Sie das Deckglas vorsichtig darauf. Das Eindeckmedium muss den gesamten Abschnitt wiederherstellen. Lassen Sie es Polymerase OVN bei RT lichtgeschützt.
    Anmerkung: Zeichnen Sie einen Kreis um den Abschnitt auf der Rückseite der Folie, bevor Sie das Montagemedium auftragen. Sobald das Eindeckmedium aufgetragen wird, kann das Gewebe schwer zu sehen sein.
11. Lagern Sie die Objektträger im Dunkeln bei 4 °C, bis sie abbildbereit sind.

>8. Bildgebung und Analyse

1. Führen Sie die Bildgebung der Färbung mit einem konfokalen Mikroskop durch.
   Anmerkung: In diesem Protokoll wurde ein inverses spektrales Laser-Scanning-Mikroskop (siehe Materialtabelle) zusammen mit den Objektiven 10x/NA 0,40 oder 60x/NA 1,4 (zur Analyse der subzellulären Lokalisation von Zytokinen) verwendet. Die Wellenlängen der Anregung und Emission werden für jedes Fluorophor und fluoreszierende Protein in der Materialtabelle angezeigt.
2. Führen Sie bei Bedarf Analysen und Quantifizierungen mit Bildverarbeitungssoftware (z. B. Imaris oder Fidschi) durch.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Brefeldin A	Cambridge Biowissenschaften	CAY11861
Paraformaldehyd	Agar wissenschaftlich	Nr. R1018
L-Lysin-Dihydrochlorid	Sigma Lebenswissenschaften	Nr. L5751
Natriummetaperiodat	Thermo Scientific	Nr. 20504
D(+)-Saccharose	VWR Chemikalien	Artikel-Nr.: 27480.294
Präzisionswischpapier Kimtech science	Kimberly-Clark Professional	Artikel-Nr.: 75512
O.C.T. Compound, Einbettmedium für die Kryotomie	VWR Chemikalien	361603E
Fc-Block, gereinigtes Anti-Maus-Mittel CD16/32, Klon 93	Biolegende	101302	Antikörperklon und verwendete Konzentration: 2,5 mg/ml
Objektträger - Superfrost Plus	VWR Chemikalien	Artikel-Nr.: 631-0108
Anti-CD169 - AF647	Biolegende	142407	Antikörperklon und verwendete Konzentration: Klon 3D6.112 1,6 mg/ml
			Anregungswellenlänge: 650
			Emissionswellenlänge: 65
Anti-F4/80 - Schützenpanzer	Biolegende	123115	Klon des Antikörpers und verwendete Konzentration: Klon BM8 2,5 mg/ml
			Anregungswellenlänge: 650
			Emissionswellenlänge: 660
Anti-B220 - PB	Biolegende	Artikel-Nr.: 103230	Klon des Antikörpers und verwendete Konzentration: Klon RA3-6B2 1,6 mg/ml
			Anregungswellenlänge: 410
			Emissionswellenlänge: 455
Anti-IFNg - Biotin	Biolegende	505804	Klon des Antikörpers und verwendete Konzentration: Klon XMG1.2 5 mg/ml
Anti-IFNg - BV421	Biolegende	505829	Klon des Antikörpers und verwendete Konzentration: Klon XMG1.2 5 mg/ml
			Anregungswellenlänge: 405
			Emissionswellenlänge: 436
gegen NKP46/NWRI	F&E-Systeme	Nr. AF2225	Antikörper-Klon und verwendete Konzentration: Ziege 2,5 mg/ml
Anti-Ziegen-IgG-FITC	Novusbio	NPp 1-74814	Antikörperklon und verwendete Konzentration: 1 mg/ml
			Wellenlänge der Anregung: 490
			Emissionswellenlänge: 525
Streptavidin - PE	Biolegende	405203	Antikörperklon und verwendete Konzentration: 2,5 mg/ml
			Anregungswellenlänge: 565
			Emissionswellenlänge: 578
Streptavidin - FITC	Biolegende	405201	Antikörperklon und verwendete Konzentration: 2,5 mg/ml
			Wellenlänge der Anregung: 490
			Emissionswellenlänge: 525
Fluoromount G	SouthernBiotech	Tel.: 0100-01
Deckgläser 22x40mm	Menzel-Glazer	12352128
Liquid Blocker super PAP PEN mini	Axxora	CAC-DAI-PAP-S-M
Imaris - Bildanalysesoftware für die Mikroskopie	Bitplane
Konfokales Mikroskop - Olympus FV1200 Laser-Scanning-Mikroskop	Olymp
Kryostat - CM 1900 UV	Leica
Basisform Einweg	Fisher Scientific Deutschland GmbH	11670990
PBS 1X	Life Technologies GmbH	20012068
BHI-Brühe	VWR Marke	303415ZA
GFP			Anregungswellenlänge: 484
			Emissionswellenlänge: 507
Rfp			Anregungswellenlänge: 558
			Emissionswellenlänge: 583
Insulinspritze, mit Nadel, 29G	VWR Deutschland	BDAM324824
C57BL/6 Wildtyp-Mäuse	Der Charles-Fluss