Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Reinigung von Blutplättchen
HINWEIS: Die Thrombozytenreinigung sollte bei Raumtemperatur durchgeführt werden, um eine Degradation zu verhindern. Achten Sie darauf, dass die Temperatur der Reagenzien und Instrumente zwischen 18 und 22 °C liegt. Um einen Abbau der Blutplättchen zu verhindern, sollten während des Eingriffs schnelles Pipettieren und kräftiges Schütteln vermieden werden.
- 600 μl Iohexol-Gradientenmedium (12 % Iohexolpulver in 0,85 % Natriumchlorid, 5 mM Tricin, pH 7,2) in ein 1,5 ml-Röhrchen geben.
- Geben Sie 200 μl Blutprobe langsam an der Seite des Röhrchens auf das Gradientenmedium mit einer Pipettenspitze mit breiter Bohrung, damit sich Blut und Iohexolmedium nicht vermischen (Abbildung 1A).
- Die Probe mit dem Röhrchen bei 400 x g für 20 min bei 20 °C in einem schwingenden Schaufelrotor mit langsamer Beschleunigung und Verzögerung zentrifugieren.
- Sammeln Sie den größten Teil der plättchenreichen Schicht und einen kleinen Teil der plättchenarmen Schicht (insgesamt 300 bis 400 μl) mit einer Pipettenspitze mit breitem Durchgang, ohne die Erythrozyten- und WBC-Schichten zu stören (Abbildung 1B). Übertragen Sie die Thrombozytenprobe in ein neues Röhrchen.
Anmerkung: Wenn die Thrombozytenzahl im Blut geringer ist oder ein kleineres Blutvolumen verwendet wird, können die plättchenreiche Schicht und die plättchenarme Schicht als eine einzige Schicht angesehen werden.
- 1 ml PBS zur Thrombozytenprobe geben, durch Invertieren mischen und 10 min bei 800 x g bei 20 °C in einem schwingenden Schaufelrotor zentrifugieren. Verwerfen Sie die Lösung vollständig und fügen Sie 200 μl PBS hinzu, um die Blutplättchen durch leichtes Pipettieren wieder zu suspendieren.
Anmerkung: Dieser Schritt ist optional, da er das Gradientenmedium und die Plasmaproteine entfernt und die Empfindlichkeit der Blutplättchen gegenüber Agonisten wie Thrombin erhöht. Da verschiedene Zentrifugen unterschiedliche Programme haben, kann die langsame Beschleunigung/Verzögerung durch Lesen der Bedienungsanleitung der Zentrifuge bestimmt werden.
- Übertragen Sie 30 μl dieser Probe in ein neues Röhrchen, um die Blutplättchen zu zählen. Die verbleibenden Blutplättchen können für biochemische und physiologische Assays wie Thrombozytenaktivierung, Aggregation, Granulatfreisetzung usw. verwendet werden.
- Für die RNA- oder Proteinextraktion zentrifugieren Sie die Thrombozytenprobe bei 800 x g für 10 Minuten, um die Blutplättchen zu pelletieren. Entsorgen Sie den Überstand vollständig, ohne das Pellet zu stören. Fügen Sie das gewünschte Volumen an RNA oder Proteinlysepuffer hinzu, um die Blutplättchen zu lysieren.
>2. Aktivierung von Blutplättchen
- Geben Sie in einem Röhrchen 1 bis 2 Millionen gereinigte Blutplättchen in bis zu 100 μl Färbepuffer (PBS mit 2 % fötalem Rinderserum, FBS).
- Für eine mehrfache Anzahl von Proben stellen Sie einen Mastermix aus Antikörpern mit 1 μl (0,5 mg/ml) der folgenden Antikörper her: PE-Cy7 Anti-Maus TER 119, PE Ratte Anti-Maus CD45, FITC Ratte Anti-Maus CD41 und APC Ratte Anti-Maus/humanes CD62P (P-Selektin) zum Nachweis von Erythrozyten, Leukozyten, Blutplättchen bzw. aktivierten Blutplättchen. Geben Sie den Mastermix in die Röhrchen, um die Zellen zu färben. Füge kein Thrombin hinzu.
- In ein anderes Röhrchen geben Sie 1 bis 2 Millionen gereinigte Blutplättchen in bis zu 100 μl Färbepuffer und 0,4 mM GPRP-Peptid. Fügen Sie Thrombin hinzu, um die Blutplättchen zu aktivieren, und färben Sie die Zellen gemäß Schritt 2.2.
Anmerkung: GPRP sollte der Probe vor der Zugabe von Thrombin zugesetzt werden, um die Bildung von Aggregaten oder Gerinnseln durch Thrombozytenaktivierung zu verhindern. Die Thrombinkonzentration sollte optimiert werden, um eine gute Aktivierung der Blutplättchen zu erreichen. Nach der Thrombozytenaktivierung ist die Ereigniszahl bei der Probenentnahme mittels Durchflusszytometrie verringert.
- Als Positivkontrolle fügen Sie 1 μl Vollblut in bis zu 100 μl Färbepuffer in einem Röhrchen und 0,4 mM GPRP-Peptid hinzu. Fügen Sie Thrombin hinzu, um die Blutplättchen zu aktivieren. Als Negativkontrolle 1 μl Vollblut in bis zu 100 μl Färbepuffer geben. Geben Sie kein Thrombin in die Negativkontrollprobe. Färben Sie die Zellen nach Schritt 2.2.
- Für die Kontrolle des Isotyps in der Durchflusszytometrie sind 5 Röhrchen mit ungefärbtem, PE-Cy7, PE, FITC und APC zu beschriften. Geben Sie 100 μl Färbepuffer, 1 μl Blut und 1 μl des jeweiligen Antikörpers in die markierten Röhrchen, um die Zellen zu färben.
- Inkubieren Sie die Proben, um sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln zu färben.
- Waschen Sie die Proben, indem Sie 1 ml Färbepuffer in jedes Röhrchen geben. Zentrifugieren Sie bei 800 x g für 5 min bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie den Fleckenpuffer vorsichtig, ohne das Pellet zu lösen.
- Geben Sie 300 μl Färbepuffer in jedes Röhrchen, mischen Sie es mild und geben Sie es in ein FACS-Röhrchen. Lagern Sie die gefärbten Proben im Dunkeln, bis sie mit einem Durchflusszytometer analysiert werden.
