Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Herstellung von Medien, Enzymlösungen und Tieren
- Bereiten Sie 1% Jodalkohol zu, indem Sie 1 g Jod in 100 ml Ethanol auflösen.
- Bereiten Sie 2x 500 ml Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) ohne Ca2+ und Mg2+ zueinander jeweils mit 7,5 ml D-Glucose (100 g/L) und 5 ml 100x Penicillin/Streptomycin Stammlösung (15 mg/ml D-Glucose, 50 U/ml Penicillin und 50 μg/ml Streptomycin final)
zu.
- Beilage 1x 500 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium mit 5 ml 100x Penicillin/Streptomycin Stammlösung (50 U/ml Penicillin und 50 μg/ml Streptomycin final).
- Bereiten Sie eine Trypsin-DNase I-Lösung (2,5 mg/ml Trypsin und 10 μg/ml DNase I) vor, indem Sie 25 mg Trypsin und 0,1 ml DNase I (1 mg/ml DNase I) zu 9,9 ml PBS hinzufügen.
- 50 mg Trypsin-Inhibitor in 5 ml PBS für Trypsin-Inhibitor A-Lösung (10 mg/ml) auflösen. 25 mg Trypsin-Hemmer in 10 ml PBS für Trypsin-Hemmer B-Lösung (2,5 mg/ml) auflösen.
- Für eine Kollagenase-Hyaluronidase-Desoxyribonuklease I (DNase I)-Lösung lösen Sie 10 mg Kollagenase A (1 mg/ml endgültig), 10 mg Hyaluronidase (1 mg/ml endgültig) und 0,1 ml DNase I (1 mg/ml DNase I) (10 μg/ml endgültig) in 10 ml PBS.
- Bereiten Sie eine Hyaluronidase-DNase I-Lösung vor, indem Sie 10 mg Hyaluronidase (1 mg/ml endgültig) und 0,1 ml DNase I-Lösung (1 mg/ml) (10 μg/ml endgültig) zu 9,9 ml PBS hinzufügen.
- Bestellen Sie Wistar-Ratten rechtzeitig, so dass sie am Tag der Isolierung der Sertoli-Zellen 19 Tage alt sind.
Anmerkung: Das beschriebene Protokoll ist für 10 Ratten ausgelegt, kann aber für mindestens 5 und maximal 20 Ratten modifiziert werden. Die Volumina aller Lösungen müssen entsprechend angepasst werden.
Im folgenden Protokoll steht eine "Pipette" für eine serologische Pipette.
>2. Präparation von Samentubuli
- Betäuben Sie 10 männliche Wistar-Ratten nacheinander in einem Exsikkator mit CO2 und einer Flussrate, die mindestens 20 % des Kammervolumens pro Minute verdrängt. Warten Sie, bis die Atmung aufhört, testen Sie die Narkose, indem Sie einen Fußballen zusammendrücken, und wenn es keine Reaktion gibt, euthanasieren Sie jede Ratte durch Gebärmutterhalsluxation. Lassen Sie das Blut ab, indem Sie die Halsvene und die Halsschlagader (Vagina carotica) unter fließendem Wasser durchtrennen. Desinfizieren Sie den Bauch, indem Sie ihn mit 70% Ethanol abwischen.
- Heben Sie mit einer Pinzette die Haut von den Bauchmuskeln ab und schneiden Sie einen ovalen Hautlappen heraus, der sich von der Schambeinsymphyse bis zum Brustbein erstreckt (Abbildung 1A) und klappen Sie ihn nach oben auf die Brust. Greifen Sie dann nach den Bauchmuskeln und machen Sie einen medialen Schnitt von der Schambeinsymphyse bis zum Brustbein.
- Drücken Sie den Bauch mit den Daumen vom Becken nach oben, um die Hoden aus dem unteren Becken herauszudrücken. Nehmen Sie das Nebenhodenfettpolster (Abbildung 1B) mit einer Pinzette, um den Hoden weiter nach oben zu ziehen. Durchtrennen Sie den Samenstrang (Abbildung 1B), lassen Sie die Tunica albuginea intakt und sammeln Sie alle Hoden in 20 ml PBS in einem konischen 50-ml-Röhrchen (Abbildung 1C).
- Nachdem Sie alle Hoden gesammelt haben, desinfizieren Sie sie, indem Sie ein gleiches Volumen (20 ml) von 1 % (w/v) Jod in Ethanol hinzufügen. Drehen Sie das Rohr zweimal um und dekantieren Sie den Überstand sofort. Waschen Sie die Hoden zweimal schnell mit je 25 ml PBS (Abbildung 1D).
- Übertragen Sie die Hoden in eine Petrischale mit 15 ml PBS (Abbildung 1E). Fassen Sie jeden Hoden an einem Ende mit einer Pinzette fest, machen Sie am gegenüberliegenden Ende einen kleinen Schnitt in die Tunica albuginea und drücken Sie die Tubuli mit geschlossenen Scherenklingen als Schabewerkzeug heraus.
Anmerkung: Die Tubuli sollten noch ein kompaktes hodenförmiges Bündel mit nur wenigen Tubuli bilden, die in die Lösung hineinragen, um einen homogenen enzymatischen Verdau zu ermöglichen (Abbildung 1F).
- Übertragen Sie die entkapselten Hoden in eine 100-ml-Flasche mit Schraubverschluss mit 10 ml Trypsin-DNase I-Lösung. Den Aufschluss in einem Schüttelwasserbad bei 32 °C (120 Schwingungen/min) durchführen. Nach 4 Minuten werden die Tubuli mit bloßem Auge auf die Dispersion der Tubuli untersucht. Sobald sich die Tubuli in der Lösung zu dispergieren beginnen, stoppen Sie den Aufschluss sofort. Falls erforderlich, die Inkubation bis zu 2 Minuten fortsetzen.
- Stoppen Sie die Trypsinverdauung, indem Sie 5 ml Trypsininhibitorlösung A hinzufügen. Mischen Sie die Lösung gründlich, indem Sie sie 3-4 Mal mit einer 10-ml-Pipette auf und ab pipettieren und in ein konisches 50-ml-Röhrchen umfüllen.
- Nach 5 Minuten Inkubation beobachten Sie, wie sich die Tubuli durch die Schwerkraft absetzen, entfernen Sie vorsichtig den Überstand mit der 10-ml-Pipette aus Schritt 2.6 und fügen Sie 10 ml Trypsininhibitor-B-Lösung hinzu, um die Trypsinverdauung vollständig zu stoppen. Resuspendieren Sie die Tubuli, indem Sie 2-3 Mal auf und ab pipettieren.
- Um kontaminierende interstitielle Zellen zu entfernen, waschen Sie die Tubuli 9 Mal mit je 25 ml PBS. Suspendieren Sie die Tubuli in jedem Waschgang mit einer 25-ml-Pipette und lassen Sie sie 10 Minuten lang durch die Schwerkraft absetzen. Verwenden Sie immer dieselbe 25-ml-Pipette zum Pipettieren von PBS, zur Resuspension und zum Entfernen des Überstands.
>3. Entnahme/Isolierung von peritubulären Zellen (PTCs)
- Übertragen Sie alle Tubuli in eine 100-ml-Flasche mit Schraubverschluss und fügen Sie die Kollagenase-Hyaluronidase-DNase I-Lösung hinzu (Abbildung 2A). Der Aufschluss wird 10 min lang in einem Schüttelwasserbad bei 32 °C (120 Schwingungen/min) durchgeführt.
- Pipettieren Sie einen Tropfen der Suspension auf einen Objektträger und überprüfen Sie die Tubuli schnell unter einem inversen Lichtmikroskop für die routinemäßige Zellkultur bei 100-facher Vergrößerung. Wenn der Aufschluss noch nicht weit genug fortgeschritten ist, die Inkubation für weitere 2 Minuten fortsetzen (die für die mikroskopische Kontrolle benötigte Zeit wird nicht mitgezählt).
Anmerkung: Während dieses Schritts werden alle Tubuli in der Länge gekürzt und die Tubulikanten sollten rau werden (Abbildung 2B und C). Raue Kanten deuten auf die Freisetzung von peritubulären Zellen hin.
- Die Suspension mit den aufgeschlossenen Tubuli wird mit der 25-ml-Pipette aus Schritt 2.8 in ein konisches 50-ml-Röhrchen überführt. Waschen Sie die 100 ml Flasche mit 10 ml PBS und geben Sie es zu den Tubuli in der konischen Tube. Lassen Sie die verdauten Tubuli 10 Minuten lang durch die Schwerkraft absetzen, und aspirieren Sie den Überstand, der die PTCs enthält, vorsichtig mit der 25-ml-Pipette und übertragen Sie ihn in ein neues konisches Röhrchen. Für die Aspiration der letzten Milliliter verwenden Sie eine 5-ml-Pipette, um eine Verschleppung der Tubuli zu verhindern.
>4. Isolierung von Sertoli-Zellen (SCs)
- Resuspendieren Sie die abgesetzten Tubuli aus Schritt 3.3 gründlich in 25 ml PBS mit einer 25 ml Pipette und lassen Sie sie 12 Minuten lang durch die Schwerkraft absetzen. Verwenden Sie dieselbe 25 ml Pipette zum Pipettieren von PBS, zur Resuspension von Tubuli und zur Entfernung von Überständen. Wiederholen Sie die Wäsche 3 Mal (insgesamt 4 Wäschen).
- Nach der letzten Wäsche werden die verdauten Tubuli in eine weitere 100-ml-Flasche mit Schraubverschluss überführt, die die Hyaluronidase-DNase I-Lösung enthält. Den Aufschluss in einem Schüttelwasserbad bei 32 °C (120 Schwingungen/min) durchführen.
- Nach 5 min werden die Tubuli erneut durch lichtmikroskopische Inspektion bei 100-facher Vergrößerung kontrolliert, wie in Schritt 3.2 beschrieben.
Anmerkung: Kurze Tubuli, röhrenförmige Aggregate und freigesetzte Zellen sollten sichtbar sein (Abbildung 2D).
- Lassen Sie die röhrenförmigen Aggregate 10 Minuten lang absetzen und aspirieren Sie den Überstand mit einer 25-ml-Pipette. Waschen Sie die Zuschlagstoffe 4-mal mit 25 ml PBS und einer Sedimentationszeit von 10 min für jeden Waschschritt (Abbildung 2E).
- Geben Sie 20 ml RPMI 1640 Medium hinzu und geben Sie die Suspension 10 Mal durch eine 18-G-Nadel, die auf einer 20-ml-Spritze montiert ist. Luftblasen vermeiden.
Anmerkung: Das Ein- und Ausziehen der Suspension durch die Nadel wird als ein Durchgang betrachtet. Der Aufschluss und die Homogenisierung von Zellen durch hydrodynamisches Scheren ist eine Standardtechnik bei der Präparation von Zellen, die zur Aggregation neigen. Es ist unwahrscheinlich, dass das Passieren einer Injektionsnadel mit kleinem Innendurchmesser einen Einfluss auf ihre funktionellen Eigenschaften hat. Abbildung 3C und D zeigen die normale Ultrastruktur von gereinigten Sertoli-Zellen am Tag 4 der Kultur.
- Pipettieren Sie einen Tropfen der Suspension auf einen Objektträger und überprüfen Sie die Tubuli schnell unter einem inversen Lichtmikroskop für die routinemäßige Zellkultur bei 10-facher Vergrößerung, wenn alle Aggregate dispergiert sind (Abbildung 2F). Die Zellsuspension wird durch ein 70 μm Zellsieb filtriert, um eine reine Einzelzellsuspension im Filtrat zu erhalten.
- Das Filtrat der Stufe 4.4 bei 200 x g für 10 min bei RT zentrifugieren, ohne die Unterbrechung zu benutzen. Den Überstand vorsichtig mit einer 25-ml-Pipette aspirieren und die Sertoli-Zellen in 40 ml RPMI 1640 Medium (serumfrei) resuspendieren.
- Mischen Sie 100 μl Zellsuspension mit 100 μl Trypanblauer Färbung und zählen Sie die Zellen mit einer Neubauer Improved Kammer. Stellen Sie die Zellkonzentration entsprechend dem Zählergebnis auf 3 x 106 Zellen/ml ein. 1 ml pro Mulde auf einer 6-Well-Platte aussäen (=Tag 1). Anmerkung: Sertoli-Zellen in Suspension setzen sich schnell ab, daher sollte das Röhrchen jedes Mal kurz geschüttelt werden, bevor ein Zellaliquot mit der Pipette entnommen wird. Bis zum 4. Tag haften sie fest am Untergrund.
