Selektive Isolierung von CD4+ Vδ1+ γδ T-Zellen aus mononukleären Zellen des humanen peripheren Blutes

Zusammenfassung

Quelle: Welker, C., et al. Isolierung und Ex vivo Kultur von Vδ1⁺CD4⁺γδ T-Zellen, einem extrathymischen αβT-Zell-Vorläufer. J. Vis. Exp. (2015).

Dieses Video demonstriert ein Protokoll zur magnetischen Markierung einer niedrig konzentrierten Population von CD4^+Vδ1+γδ T-Zellen aus humanen mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs). Mit einer Kombination aus FITC-konjugierten Anti-Vδ1-Antikörpern, magnetischen Anti-FITC-Mikrokügelchen und mit Anti-CD4-Antikörpern beschichteten superparamagnetischen Kügelchen können die CD4⁺Vδ1⁺ T-Zellen erfolgreich aus der PBMC-Population aufgereinigt werden.

Protokoll

Alle Eingriffe mit menschlichen Teilnehmern wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für das Wohlergehen des Menschen durchgeführt und vom lokalen institutionellen Prüfungsausschuss überprüft.

>1. Isolierung von Vδ1 T-Zellen

1. Nehmen Sie <1 x 10⁶ isolierte Lymphozyten für eine erste FACS, die die Häufigkeit von Vδ1 CD4 T-Zellen bestimmt.
   Anmerkung: Die Populationsgröße dieser T-Zell-Einheit kann von Individuum zu Individuum und je nach immunologischem Zustand stark variieren. Typischerweise sind etwa 1% der T-Zellen ^Vδ1+ und etwa 1-5% der Vδ1⁺-Zellen CD4⁺.
   1. Verdünnen Sie die Zellen mit 1 ml FACS-Puffer, der aus PBS mit 2 % FCS und 5 mM EDTA besteht. Bei 660 x g 2 min zentrifugieren und den Überstand dekantieren. Das Rückflussvolumen von ca. 100 μl FACS-Puffer ist für die anschließende Färbung ausreichend. Die Zellen kurz vortex und inkubieren Sie sie mit 5 μl Fc-Blocking Reagenz für 5 min bei RT, um die Spezifität der FACS-Färbung zu erhöhen.
   2. Geben Sie humane monoklonale Antikörper direkt in die Zellen, ohne das Fc-Blockierungsreagenz zu entfernen. Achten Sie darauf, die Zellen mit Antikörpern gegen Vδ1 (1:50), CD3 (1:50), CD4 (1:200), CD8 (1:200) und TCRαβ (1:25) zu färben. Bereiten Sie die Isotypkontrolle mit den entsprechenden Immunglobulin-Isotypen vor. Zellen mit Antikörpern 20 min bei 4 °C im Dunkeln inkubieren.
   3. Die Zellen werden in 1 ml FACS-Puffer gewaschen (2 min zentrifugiert; bei 660 x g), den Überstand dekantieren und mit der FACS-Erfassung im verbleibenden Puffervolumen fortfahren.
2. Die Zellen (die nicht in der FACS-Analyse verwendet werden) werden durch Zentrifugation für 12 min; bei 300 g; 8 °C pelletiert. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 60 μl MACS-Puffer pro 1 x 10⁷ Zellen. 20 μl Fc-Blocking Reagenz pro 1 x 10⁷ Zellen zugeben und 5 min bei 4°C inkubieren.
3. Geben Sie 10 μl FITC-konjugierten anti-humanen Vδ1-Antikörper pro 1 x 10⁷ Zellen direkt in die Zellen. 12 min bei 4 °C im Dunkeln inkubieren.
4. Die Zellen mit 14 ml MACS-Puffer waschen (12 min zentrifugieren; bei 300 g; 8 °C). Entsorgen Sie den Überstand vollständig und resuspendieren Sie die Zellen in 80 μl MACS-Puffer pro 1x10⁷ Zellen.
5. Nehmen Sie 1-2 x 10⁵ Zellen und verdünnen Sie sie in 100 μl FACS-Puffer zur Überprüfung der Markierung durch FACS-Analyse. Für diesen Schritt werden keine weiteren Zusatzstoffe benötigt. Achten Sie darauf, dass ein ausreichender Helligkeitsunterschied für Vδ1^- und ^Vδ1+-Zellen vorhanden ist. Ist dies nicht der Fall, wiederholen Sie die Schritte 1.3 und 1.4.
6. 20 μl Anti-FITC-Mikrokügelchen pro 1 x 10⁷ Zellen zu den restlichen Zellen geben, gut mischen und 15 min im Dunkeln bei 4 °C inkubieren. Danach die Zellen mit mindestens 10 ml MACS-Puffer waschen (12 min zentrifugieren, bei 300 x g; 8 °C).
7. Während der Zentrifugation wird die vorgekühlte Magnetsäule, die in einem Magneten mit 500 μl MACS-Puffer platziert ist, äquilibriert.
8. Resuspendieren Sie die Zellen in 500 μl MACS-Puffer (bei Zellzahlen über 1 x 10⁸ skalieren Sie dieses Volumen entsprechend hoch) und tragen Sie die Zellen vorsichtig auf die Säule auf. Sammeln Sie den Durchfluss, der die ^Vδ1-Zellen enthält.
9. Waschen Sie die Säule dreimal mit 500 μl MACS-Puffer und sammeln Sie den Durchfluss wieder im selben Röhrchen. Beachten Sie, dass das Reservoir leer sein muss, bevor Puffer auf die Säule angewendet wird.
10. Nehmen Sie die Säule aus der magnetischen Vorrichtung und legen Sie sie in ein konisches 15-ml-Röhrchen. Spülen Sie die Säule schnell mit 1 ml MACS-Puffer, indem Sie den Kolben fest in die Säule drücken. Sammeln Sie das Eluat in einem Röhrchen.
    HINWEIS: Um eine Reinheit von >98% zu erreichen, ist es in der Regel notwendig, die Schritte 1.7-1.9 mit einer zweiten Säule zu wiederholen.
11. Die Reinheit der Zellen wird durch FACS-Analyse mit dem gleichen Antikörperpanel wie zuvor (siehe 1.1.2) überprüft und die Zellen gezählt.

>2. Isolierung von Vδ1CD4⁺ T-Zellen

1. 25 μl CD4-Kügelchen werden >30 Sek. lang mit einem Wirbel resuspendiert. Waschen Sie die Kügelchen (die vom Hersteller angegebene Mindestmenge) in 1 ml MACS-Puffer in einem 1,5-ml-Reaktionsröhrchen, indem Sie das Röhrchen 1 Minute lang in einen Magneten legen. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig mit einer kleinen Pipette (200 μl) und resuspendieren Sie die Kügelchen im ursprünglichen Volumen des MACS-Puffers.
2. Pelletieren Sie die Vδ1⁺-Zellen (zentrifugieren Sie 12 min; bei 300 x g) und aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie alle Vδ1⁺-Zellen in 500 μl MACS-Puffer und geben Sie sie in das Röhrchen mit den Kügelchen. Kräftig mischen und 20 min bei 4 °C unter ständigem Kippen (z. B. in einem Rotator) inkubieren.
3. Legen Sie das Röhrchen mit den Zellen für 2 Minuten in einen Magneten. Stellen Sie sicher, dass sich keine Reste im Deckel befinden.
   HINWEIS: CD4⁺-Zellen haben die magnetischen Kügelchen gebunden und an der dem Magneten zugewandten Seite des Rohrs befestigt.
4. Öffnen Sie vorsichtig den Deckel, während Sie das Röhrchen in der magnetischen Vorrichtung belassen, und sammeln Sie den Überstand, der die ^CD4-Vδ1+-Zellen enthält, mit einer kleinen Pipette. Legen Sie CD4-Vδ1⁺-Zellen in ein separates Röhrchen und setzen Sie dieses Röhrchen wieder in den Magneten ein, um möglicherweise verbleibende ^CD4-Zellen oder -Kügelchen aus der Population zu vermeiden.
   1. Die ^CD4-Zellen werden in 5 ml MACS-Puffer gewaschen (12 min zentrifugiert; bei 300 x g) und in einer Konzentration von 1 x 10⁵ Zellen pro 100 μl Medium resuspendiert. ^CD4-Zellen können unter geeigneten Bedingungen problemlos kultiviert werden.
5. Platzieren Sie das Röhrchen mit den CD4⁺-Zellzielen außerhalb des Magnetfelds, resuspendieren Sie die Zellen in 500 μl MACS-Puffer und setzen Sie sie wieder in das magnetische Gerät ein. Wiederholen Sie die Schritte 2.3-2.5 zweimal, um eine höhere Reinheit zu erhalten. Überstand durch Pipettieren entfernen.
6. Resuspendieren Sie die CD4⁺-Zellen in 100 μl Nährmedien (RPMI 1640, 10 % FCS, 1 % L-Glutamin, 1 % Penicillin/Streptomycin) und fügen Sie 10 μl einer Bead-Ablöselösung hinzu. Inkubieren Sie 45 Minuten lang bei RT mit konstantem Kippen (z. B. in einem Rotator).
7. Legen Sie die Zellen für 1 Minute in einen Magneten. Sammeln Sie den Überstand mit den kügelchenfreien ^Vδ1+CD4⁺-Zellen vorsichtig mit einer kleinen Pipette.
8. Außerhalb des Magneten resuspendieren Sie die Kügelchen mit 100 μl Nährmedien und wiederholen Sie die Schritte 2.6 und 2.7 zweimal, um eine höhere Zellzahl von CD4⁺-Zellen zu erhalten.
9. Die Zellen werden pelletiert (Zentrifuge bei 300 x g, 12 min) und der Überstand wird durch Pipettieren vollständig verworfen. Resuspendieren Sie die Zellen in frischen, vorgewärmten Medien und zählen Sie sie. Untersuchen Sie die Reinheit der ^Vδ1+CD4⁺-Zellen durch FACS-Analyse, wie in den Schritten 1.1.1 bis 1.1.3 dargestellt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Sigma Aldrich	Nr. D8537
MACS-Puffer	Miltenyi Biotec	Tel.: 130-091-222	mit BSA ergänzen und vor Gebrauch vorkühlen
Bsa	Miltenyi Biotec	Tel.: 130-091-376	nicht zwingend von diesem Lieferanten
Anti-Human-Vd1 FITC (Klon: TS8.2)	Thermo Scientific	TCR2730	nicht zwingend von diesem Lieferanten
Anti-Human-CD3 PerCP (Klon: SK7)	BD Biowissenschaften	345766	nicht zwingend von diesem Lieferanten oder diesem Fluorochrom
Anti-Human-TCRab PE (Klon: T10B9.1A-31)	BD Biowissenschaften	555548	nicht zwingend von diesem Lieferanten oder diesem Fluorochrom
Anti-Human-CD4 VioBlue (Klon: MT466)	Miltenyi Biotec	Tel.: 130-097-333	nicht zwingend von diesem Lieferanten oder diesem Fluorochrom
Anti-Human-CD8 APC-H7 (Klon: SK1)	BD Biowissenschaften	Artikel-Nr.: 641400	nicht zwingend von diesem Lieferanten oder diesem Fluorochrom
Anti-FITC MultiSort Kit	Miltenyi Biotec	Tel.: 130-058-701	Liefert bessere Ergebnisse als Anti-FITC-MicroBeads
MS-Spalten	Miltenyi Biotec	Artikel-Nr.: 130-042-201	Vor Gebrauch vorkühlen
MiniMACS-Trennzeichen	Miltenyi Biotec	Artikel-Nr.: 130-042-102
CD4-Kit für positive Isolierung	Lebenstechnologien	11331D