Eine In-vitro-Technik zur Erzeugung von extrazellulären Fallen für humane Neutrophile

Zusammenfassung

Quelle: Najmeh, S., et al. Vereinfachte Isolierung und Handhabung von extrazellulären Neutrophilenfallen (NETs). J. Vis. Exp. (2015)

Dieses Video zeigt eine in vitro Technik zur Erzeugung und Isolierung von neutrophilen extrazellulären Fallen (NETs). Neutrophile werden aus peripherem Blut isoliert und mit Phorbolmyristatacetat (PMA) stimuliert, um NETs zu produzieren. Während der Inkubation durchlaufen die Neutrophilen einen Prozess des Zelltods (NETose), um NETs freizusetzen, die aus dekondensiertem Chromatin bestehen, das mit granulären zytoplasmatischen Proteinen gemischt ist.

Protokoll

Alle Eingriffe mit menschlichen Teilnehmern wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für das Wohlergehen des Menschen durchgeführt und vom lokalen institutionellen Prüfungsausschuss überprüft.

>1. Generierung von NETs

1. Neutrophile werden mit 500 nM PMA (pro 30 ml Neutrophilenlösung) stimuliert und auf einer 150 x 25 mm großen flachen Gewebekulturschale mit einem 20-mm-Gitter für 4 Stunden bei 37 °C 5 % CO₂ inkubiert. Dies ermöglicht NETosis.
2. Nach 4 Stunden Stimulation aspirieren und verwerfen Sie das Medium vorsichtig, wobei die Schicht aus NETs und Neutrophilen am Boden haftet. Unterbrechen Sie diese Schicht nicht.
3. Waschen Sie mit insgesamt 15 ml kaltem PBS ohne Ca und Mg pro Schale den Boden jeder Schale, indem Sie 15 ml PBS auf den Boden der Schale pipettieren, um sämtliches anhaftendes Material vom Boden abzuheben.
4. Die Lösung, die durch das Spülen jedes Geschirrs (Schritt 1.3) gewonnen wurde, wird in einem konischen 15-ml-Röhrchen aufgefangen und 10 Minuten lang bei 450 x g bei 4 °C zentrifugiert. Neutrophile Zellen und alle verbleibenden Zellen pelletieren am Boden, so dass ein zellfreier NET-reicher Überstand zurückbleibt.
5. Überstand in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen aufteilen und 10 min bei 18.000 x g bei 4 °C schleudern. Dadurch kann die gesamte DNA pelletieren.
   Anmerkung: Die Zentrifugation in größeren Röhrchen ist einfacher und weniger zeitaufwändig, wenn solche hohen Geschwindigkeiten mit der regulären Zentrifuge erreicht werden können, andernfalls müssen die Überstände in kleinere Röhrchen aufgeteilt werden, um eine Hochgeschwindigkeits-Mikrozentrifuge zu verwenden.
6. Der Überstand wird verworfen und alle zusammen erhaltenen Pellets in eiskaltem PBS auf eine Konzentration resuspendiert, die 2 x 10⁷ Neutrophilen pro 100 μl PBS entspricht. Dies ergibt den zellfreien NET-Vorrat, der für nachfolgende Experimente verwendet werden kann.
7. Messen Sie die DNA-Konzentration in der Probe, die mit Hilfe der Spektrophotometrie oder eines alternativen DNA-Quantifizierungswerkzeugs gewonnen wurde. Eine angemessene Konzentration in der Probe sollte zwischen 140 und 180 ng/μl liegen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Dulbecco's Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), modifiziert, ohne Calciumchlorid und Magnesiumchlorid	Wisent	311-425-CL
RPMI-1640 Medium mit L-Glutamin	Wisent	350-000-CL	Die 3%ige RPMI-Lösung wird durch Supplementierung von RPMI mit 3% fötalem Rinderserum hergestellt
Phorbol 12-Myristat-13-acetat (PMA)	Sigma-Alrdrich	Nr. P8139
Fötales Rinderserum (FBS)	Wisent	080-150
Integride Gewebekulturschale mit 20mm Raster (150 x 25mm)	Falke	353025