Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Bereiten Sie sich im Voraus
vor
- Bereiten Sie das Komplettmedium vor: RPMI, ergänzt mit 2 mM L-Glutamin, 100 Einheiten/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin und 10 % FBS.
- DNase-Medien vorbereiten: 50 ml RPMI-Medien, ergänzt mit 7,5 μg DNase (Frisch machen, immer auf Eis halten).
- Kollagenase-DNase-Medium vorbereiten: 5 ml DNase-Medium plus 3,2 mg/ml Kollagenase Typ IV (Frisch machen, immer auf Eis halten).
- Die Zentrifuge auf 4 °C abkühlen lassen.
- Schüttel-Inkubator auf 37 °C warmhalten.
>2. Isolierung, Dissektion und Zellisolierung aus Zahnfleischblöcken
- Euthanasieren Sie Mäuse, indem Sie sie in einer geeigneten Kammer CO2 aussetzen, gemäß den Richtlinien des Animal Research Advisory Committee (ARAC).
- Öffnen Sie die Brust- und Bauchhöhle, um das Herz und die inneren Organe freizulegen. Zur Perfusion machen Sie einen Schnitt in der unteren Hohlvene und perfundieren Sie 3 ml PBS über den linken Ventrikel mit einer 3 ml Spritze und einer 27 G Nadel.
- Lege den Körper und den Kopf der Maus mit dem Bauch nach oben auf einem Pad ruhig
.
- Schneiden Sie jede Kommissur der Lippe in Richtung Hals mit einer Schere, trennen Sie die Haut, die den Unterkiefer und den Halsbereich bedeckt, und legen Sie das darunter liegende Gewebe und die Muskeln frei. Präpariere die Unterlippe, um den Unterkiefer freizulegen.
- Schneiden Sie zwischen den unteren Schneidezähnen, um beide Seiten des Unterkiefers zu trennen, und fixieren Sie jede Seite, um Zugang zur Mundhöhle zu erhalten.
- Visualisieren und präparieren Sie den Gaumen weg von der Nasenhöhle.
- Präparieren Sie Bereiche mit einer 10-Klinge und schließen Sie Oberkiefer- und Unterkiefermolarenbereiche mit umgebender Gingiva ein (Abbildung 1). Machen Sie vertikale Schnitte nur vor dem ersten Backenzahn und hinter dem dritten Molaren und einen horizontalen Schnitt am Rand der Gingiva (weißer Kragen des Zahngewebes, das die Zähne umgibt).
- Legen Sie die Oberkiefer- und Unterkieferblöcke in ein konisches 50-ml-Röhrchen mit 5 ml Kollagenase/DNase (auf Eis halten).
- Inkubieren Sie in einem Schüttel-Inkubator bei 37 °C für 1 Stunde und fügen Sie während der letzten 5 Minuten der Inkubation 50 μl 0,5 M EDTA hinzu.
- Geben Sie 5 ml kaltes DNase-Medium mit Taschentüchern in das 50-ml-Röhrchen und schwenken Sie es vorsichtig, um es zu mischen.
- Übertragen Sie die 4 Gewebeblöcke in eine Petrischale und bedecken Sie sie mit 500 μl DNase-Medium. Entfernen Sie die Gingiva von jedem Gewebeblock, indem Sie mit einer Skalpellklinge die Klinge in den Zahnfleisch- und Interdentalbereich richten.
- Übertragen Sie das Gewebe und das Medium aus der Petrischale sowie das bisherige DNase-Medium, das bei der Dissektion verwendet wurde, durch das Zellsieb (70 μm Größe) in ein neues 50-ml-Röhrchen. Waschen Sie alle verwendeten Instrumente mit DNase-Medien (3-5 ml) und filtern Sie sie.
Mit - dem Kolben einer sterilen 3-ml-Spritze das Gewebe gegen das Sieb drücken und mit kaltem DNase-Medium (30 bis 35 ml) filtrieren.
- Waschen Sie das Zellsieb mit kaltem DNase-Medium.
- Zentrifugieren Sie bei 4 °C, 314 x g für 6 min.
- Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie ihn in 1 ml vollständigem Medium erneut.
- Zählen Sie Zellen (die erwartete Menge sollte zwischen 8 x 105 und 1,2 x 106 Zellen mit einer Lebensfähigkeit von >80%) mit einem automatisierten Zellzähler liegen.
