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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Lungengewebe-Proben
HINWEIS: Für in vivo Studien von Lungengewebe untersuchen Sie die Proben nach der relevanten Exposition. Die Exposition, die für dieses Experiment am relevantesten ist, sind infektiöse Mikroorganismen, insbesondere Bakterien. Mausstämme, die für diese Methode verwendet werden könnten, sind C57BL/6- oder BALB/c-Mäuse, 10 - 12 Wochen alt, 25 - 30 g schwer und männlich.
- Euthanasieren Sie Mäuse durch eine intraperitoneale Injektion von Ketamin (400 mg/kg) und Xylazin (40 mg/kg). Öffnen Sie die Brusthöhle und legen Sie die Lunge und das Herz mit einer chirurgischen Zange und Schere frei.
- Infundieren Sie warmes PBS mit einer 21-Gauge-Nadel in den rechten Ventrikel, um das Blut 30 s lang aus den Gefäßen auszuwaschen, und infundieren Sie dann 30 s lang 10 ml 2% PLP-Fixiermittel (in den rechten Ventrikel).
- Verwenden Sie warmes PBS (42 °C), um die offene Brusthöhle zu spülen. Intubieren Sie die Luftröhre mit einer 21-Gauge-Nadel und einem Stück 0,8-mm-Schlauch, der auf die richtige Größe zugeschnitten ist, und injizieren Sie 800 μl vorgewärmte (auf 42 °C) und 3%ige Agaroselösung mit niedrigem Schmelzpunkt.
- Binden Sie die Luftröhre mit geflochtener Seide (4.0 USP) ab. Legen Sie den Faden um die Luftröhre, direkt unterhalb des Einführpunkts der Kanüle, und befestigen Sie ihn mit einem einfachen Überhandknoten. Um die Agarose zu verfestigen, verabreichen Sie eiskaltes PBS um die Lunge. Entfernen Sie die Lunge und das Herz als Block aus der Brusthöhle mit einer Schere und einer stumpfen Dissektion. Entfernen Sie jede Lunge einzeln und fixieren Sie sie dann für 16 h in 2% PLP oder Formalin bei 4 °C.
- Lagern Sie die Proben in PBS bei 4 °C bis zum Gewebeschnitt
.
- Um die Lungengewebeproben vorzubereiten, gehen Sie wie folgt vor.
- Lungengewebe (reseziert in Schritt 1.1) in 10 % natürlich gepuffertem Formalin für 24 h bei Raumtemperatur fixieren. Auf 75 % Ethanol umfüllen und in einem 12-stündigen Zyklus in einen Tissue-Prozessor geben (2,5 h in 75 % EtOH, 3 h in absolutem EtOH, 3,5 h in Lösungsmittel 3B und 3 h in Paraffin).
- Einbetten in Standard-Paraffin, um formalingebundene, paraffineingebettete (FFPE) Blöcke herzustellen, die bei Raumtemperatur gelagert werden.
Anmerkung: In diesem Stadium ist es in der Regel zweckmäßig, die Lungenabschnitte für Standard-Objektträger zu schneiden.
- Schneiden Sie die FFPE-Lungenabschnitte mit einem Mikrotom in einer Dicke von 4 - 5 μm ab und montieren Sie sie auf geladene, beschichtete Objektträger.
- Um Dias zu montieren, geben Sie 3 Tropfen Eindeckmedium auf 60 mm x 24 mm Deckgläser (Größe 1,5), drehen Sie das Dia auf dem Deckglas um und drücken Sie überschüssiges Medium heraus. Versiegeln Sie sie hermetisch mit Nagellack und lagern Sie sie bei Raumtemperatur.
>2. Präparation/Mikroskopie von Lungengewebeproben
- Zur Entwachsung, Rehydrierung und Vorbehandlung der FFPE-Lungengewebeprobe mit Antigen-Rückgewinnungslösung.
- Trocknen Sie die FFPE-Objektträger 60 min lang bei 60 °C im Ofen. Legen Sie dann die Objektträger für 30 min in Xylollösung und überführen Sie sie für 5 min bei Raumtemperatur in 70%ige Ethanollösung. In Leitungswasser abspülen.
- In hitzebeständige Frischhaltefolie legen und der HIER-Antigen-Entnahme unterziehen, in einem Schnellkochtopf für 10 min in 10 m/mol/L Tris, 1 mmol/EDTA, pH 9,0. 20 Min. kühl stellen. Zweimal 5 Minuten lang in Leitungswasser auf einer Wippe waschen, dann einmal mit PBS auf einer Wippe.
- Mit 10 % Hühnerserum in 5 % BSA/PBS 30 min bei Raumtemperatur blockieren.
- Färbe das Gewebe.
- Um METs in Makrophagen zu definieren, fügen Sie Primärantikörper (MMP-9, H3Cit und F4/80) in 1 % BSA/PBS für 16 h bei 4 °C bei 1/100 Verdünnung hinzu (genaue Einzelheiten zu den Antikörpermengen sind in der Materialtabelle aufgeführt). Zweimal mit PBS 5 min auf einer Wippe waschen.
- Fluoreszenzdetektion durch Inkubation mit entsprechenden Sekundärantikörpern in 1 % BSA/PBS für 40 min bei Raumtemperatur. Antikörper sind: (1) Huhn Anti-Maus 488 (grün), (2) Huhn Anti-Ziege 594 (rot) und (3) Esel Anti-Maus 647 (dunkelrot).
- Waschen Sie die Schnitte in PBS und montieren Sie sie mit einem DAPI-haltigen Eindeckmedium für die Chromatinfärbung.
- Fluoreszierende Bilder erhalten Sie mit einem konfokalen Laserscankopf, der an einem inversen Mikroskop befestigt ist.
- Stimulieren Sie die Vorbereitung mit 405-, 488-, 561- und 647-nm-Lasern. Nehmen Sie Bilder mit einer Größe von 512 x 512 Pixeln in einer Ebene auf, indem Sie auf die Schaltfläche für die sequenzielle Nivellierung (2-Linien-Mittelwertbildung) mit 20 x 0,1 NA Luft- und 40 x 1,0 NA Ölobjektiven klicken.
- Erhalten Sie mindestens zehn Sichtfelder pro Schnitt für die Analyse und Daten für jedes Ergebnis (d. h. 10 Hochleistungs-Sichtfelder (HFOV) für die Kontrolle, 10 für die stimulierte Probe usw. für jede Maus).
Anmerkung: Um eine repräsentative Stichprobe des gesamten Feldes zu erhalten, kann ein Matrixsystem verwendet werden, in dem das Feld in verschiedene Abschnitte unterteilt wird, und für jede verschiedene Probe wird dieselbe Matrix verwendet, um Sichtfelder auszuwählen (z. B. kann das Feld in 9 Abschnitte unterteilt werden, und zwar von der Mitte und den 4 Ecken, zwei HFOV genommen werden).