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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
HINWEIS: Ein schematischer Ablauf der Methode ist in Abbildung 1 beschrieben.
>1. Vorbereitung des Materials
HINWEIS: Bereiten Sie alle Reagenzien aseptisch in einer sterilen Haube vor, aliquotieren Sie sie und lagern Sie sie bei der angegebenen Temperatur. Die Reagenzien können bis zu 2 Jahre gelagert werden, ohne ihre Wirkung zu verlieren.
- Bereiten Sie CFA mit 20 mg/ml Mycobacterium tuberculosis wie unten beschrieben vor.
- Geben Sie 100 mg gefriergetrocknetes M. tuberculosis H37RA (siehe Materialtabelle) und fünf 3,2 mm Stahlperlen in ein 7-ml-Röhrchen (siehe Materialtabelle). Schütteln Sie das Röhrchen in einem Homogenisator (siehe Materialtabelle) für 60 s bei der höchsten Drehzahleinstellung (5.000 U/min).
- Geben Sie 5 mL unvollständiges Freund-Adjuvans (IFA) in das Röhrchen und schütteln Sie es erneut 60 s lang bei höchster Geschwindigkeit. Die Aufschlämmung von homogenisiertem M. tuberculosis in IFA (jetzt CFA genannt) wird mit einer Pipette in ein frisches Röhrchen gegeben, die Kügelchen zurückgelassen und bis zur Verwendung bei 4 °C gelagert.
- Fügen Sie dem gefriergetrockneten Pulver des Peptids MOG35-55 ultrareines Wasser hinzu (siehe Materialtabelle), um eine endgültige Peptidkonzentration von 10 mg/ml zu erhalten. Sterilisieren Sie die Lösung, indem Sie sie durch einen 0,2-μm-Filter leiten. 60 μl Aliquots vorbereiten und bis zur Verwendung bei -20 °C lagern.
Anmerkung: Das für dieses Experiment verwendete MOG35-55-Peptid ist von ImmunoGrade-Reinheit (~70%), ist TFA-gespalten, löst sich leicht in Wasser auf und enthält ein C-terminales Amid (-NH2), um die In-vivo-Stabilität zu erhöhen. Peptid-Aliquots wurden nie mehr als zweimal aufgetaut und wieder eingefroren und bis zur Verwendung bei -20 °C gelagert.
>2. Herstellung von CFA/Peptid-Emulsionen
- Berechnen Sie die Menge an Emulsion, die für die Immunisierung benötigt wird. In diesem Standardprotokoll erhält jede Maus 50 μg MOG35-55 Peptid und 300 μg M. tuberculosis, dispergiert in Freund's Adjuvans (CFA). Die Menge jedes Reagenzes (MOG35-55 Peptid, PBS, CFA und IFA), die für die Herstellung der Emulsionen erforderlich ist, kann mit Hilfe der ergänzenden Datei 1 berechnet werden. Weitere 20% aller Reagenzien, um den geringen Emulsionsverlust auszugleichen, werden in die Berechnung einbezogen.
Anmerkung: Das in dieser Studie verwendete kommerzielle Emulsionskit (siehe Materialtabelle) besteht aus einem Röhrchen, einem Schraubverschluss und einem Kolben in einem sterilisierten Beutel. Jedes Röhrchen des Emulsionskits fasst maximal 9,6 ml, so dass 8 x 1 mL-Spritzen hergestellt werden können, die für die Immunisierung von 40 Mäusen (oder 80 Mäusen bei Verwendung von 100 μl Emulsion pro Tier) ausreichen.
- Legen Sie das Schraubrohr (aus dem handelsüblichen Emulsionskit) und die zu verwendenden Reagenzien auf Eis.
- Die Emulsionskomponenten werden in der folgenden Reihenfolge in die in Schritt 2.1 berechneten Volumina gegeben: PBS, dann das Peptid, dann M. tuberculosis in CFA und schließlich IFA.
- Verschließen Sie die Tube mit der Kappe fest, indem Sie sie mehrmals festziehen und lösen. Schütteln Sie das Röhrchen 5-10 s lang kräftig von Hand, um die Reagenzien vorzumischen.
- Legen Sie das Röhrchen in den Schüttelhomogenisator und sichern Sie es mit dem Stab. Stellen Sie die Geschwindigkeit auf die höchste Stufe und die Zeit auf 60 s ein. Sobald der Lauf beendet ist, lege die Röhre für 3 Minuten auf Eis. Wiederholen Sie den Lauf noch ein oder zwei Mal mit denselben Einstellungen.
- Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 300 x g für 1 min, um eingeschlossene Luft zu entfernen und die Emulsion zu verdichten.
- Entfernen Sie die Kappe von der Tube, setzen Sie den Kolben in die Tube ein und drücken Sie ihn langsam nach unten, bis er die Oberseite der Emulsion erreicht. Entfernen Sie den Schnappverschluss an der Unterseite des Rohres, indem Sie ihn drehen.
- Entfernen Sie den Kolben von einer Injektionsspritze (1 ml; siehe Materialtabelle). Geben Sie eine Nadel (vorzugsweise 25-27 G) in die Injektionsspritze.
- Befestigen Sie das hintere Ende der Injektionsspritze an der speziellen Verriegelung an der Unterseite des Schlauchs und verriegeln Sie sie mit einer kurzen Drehung.
- Übertragen Sie die Emulsion vom Schlauch auf die Injektionsspritze, indem Sie den Kolben leicht drücken. Stoppen Sie, wenn die Emulsion die 0,15-ml-Teilung der Injektionsspritze erreicht.
- Trennen Sie die Injektionsspritze vom Schlauch und führen Sie den Kolben vorsichtig ein, wobei Sie darauf achten, dass keine Luft in die Spritze eindringt. Schieben Sie den Kolben, bis die Emulsion aus der Nadel austritt.
Anmerkung: An dieser Stelle kann ein Teil der Emulsion für die Qualitätskontrolle verwendet werden (siehe Schritt 3).
- Die Schritte 2.8-2.11 für den Rest der in der Tube vorhandenen Emulsion wiederholen.
Anmerkung: Um die Verschwendung teurer CFA/Antigen-Emulsionen zu minimieren, sollten 1-ml-Spritzen verwendet werden. Es können auch andere Spritzen verwendet werden, die in den speziellen Verschluss am Boden des Schlauchs passen. Es kann jedoch erforderlich sein, ein größeres Volumen der Emulsion herzustellen. Die CFA/MOG35-55 Peptidemulsion kann bis zu 15 Wochen bei 4 °C gelagert werden, ohne ihre EAE-induzierende Kapazität zu verlieren.
>3. Qualitätskontrolle der Emulsion
- Falltest: Geben Sie einen kleinen Tropfen der Emulsion in ein steriles konisches 50-ml-Röhrchen, das mit 20 mL kaltem Wasser gefüllt ist. Schließen Sie die Tube und schütteln Sie sie einige Sekunden lang mit der Hand. Das Auftreten winziger, deutlicher Tröpfchen bestätigt die Bildung einer Wasser-in-Öl-Emulsion.
- Untersuchen Sie die Emulsion mit Hilfe der Phasenkontrastmikroskopie.
- Um die Größe der Wasser-in-Öl-Partikel zu analysieren, geben Sie einen winzigen Tropfen (2-3 μl) der Emulsion auf einen Objektträger, schmieren Sie ihn mit einem Deckglas aus und drücken Sie dann in kreisenden Bewegungen kräftig an, um die Emulsion zu glätten.
- Untersuchen Sie die verschmierte Emulsion unter einem Phasenkontrastmikroskop (siehe Materialtabelle) mit 400-facher Vergrößerung und fokussieren Sie auf ein Feld mit einer Monoschicht der Emulsion. Stellen Sie sicher, dass kleine, gleichmäßige graue/weiße Partikel sichtbar sind (Abbildung 2A).
