Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Vorbereitung der Maus
HINWEIS: Der folgende Eingriff, einschließlich der Vorbereitung und Operation der Tiere, dauert 30–40 Minuten. Schalten Sie vor der Operation das Mikroskop ein und erwärmen Sie den geschlossenen Inkubator am Mikroskop auf 37 °C.
- Durchführung von Experimenten an 8–10 Wochen alten TcrdEGFP-Mäusen auf einem C57BL/6-Hintergrund, die von Bernard Malissen (INSERM, Paris, Frankreich) gewonnen wurden. Gemäß dem von der IACUC zugelassenen Verfahren wird die Maus durch i.p. Injektion von Ketamin (120 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) basierend auf dem Gewicht des Tieres anästhesiert. Beurteilen Sie den Grad der Anästhesie anhand der Atemfrequenz (55–65 Atemzüge pro Minute), des Zehenkneifens und des Lidreflexes.
- Sobald die Anästhesie in der Operationsebene erreicht ist, befestigen Sie die Hinterbeine der Maus mit Klebeband auf einem Heizkissen, um die Körpertemperatur aufrechtzuerhalten, die mit einem Rektalthermometer überwacht werden kann. Wenn es Anzeichen dafür gibt, dass die Anästhesie nachlässt (z. B. erhöhte Atemfrequenz, Blinzeln und/oder zuckende Reaktion der Augenmuskeln auf den Lidreflex), verabreichen Sie jeweils 50 μl Ketamin/Xylazin erneut, bis die Maus vollständig sediert ist.
- Bereiten Sie den Kernfarbstoff vor, indem Sie 50 μl Hoechst 33342 (10 mg/ml) mit 315 μl 0,9 % Kochsalzlösung verdünnen; die Endkonzentration beträgt 37,5 mg/kg, bezogen auf das Gewicht der Maus (ca. 200 μl Volumen). Sobald die Maus betäubt ist, injizieren Sie das Hoechst langsam mit einer Tuberkulinspritze durch den retroorbitalen Venensinus.
HINWEIS: Warten Sie 1–2 Minuten, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren, damit sich die Maus an die Änderung des zirkulierenden Volumens nach der retroorbitalen Injektion gewöhnen kann.
- Tragen Sie eine kleine Menge Gleitmittel auf die Augen auf, damit sie nicht austrocknen.
>2. Mauschirurgie: Laparotomie zur Freilegung der Darmschleimhaut
- Machen Sie einen 2 cm langen vertikalen Schnitt durch die Haut und das Bauchfell entlang der Mittellinie des Unterbauchs, um den abzubildenden Bereich des Darms nach außen zu verlagern.
- Ziehen Sie mit einer abgewinkelten Pinzette vorsichtig den Blinddarm aus der Bauchhöhle und identifizieren Sie den Bereich des Dünndarms, der abgebildet werden soll. Achten Sie darauf, dass Sie bei diesem Vorgang keine mesenterialen Blutgefäße zerreißen. Um mögliche Schäden oder Blutungen zu minimieren, vermeiden Sie es, den Darm mit einer Pinzette zu greifen oder zu kneifen.
- Lokalisieren Sie eine geeignete Region des Dünndarms (2–3 cm) für die Bildgebung, die nur minimalen Stuhlinhalt enthält. Den Blinddarm und den restlichen Dünndarm vorsichtig in die Bauchhöhle zurückführen, während das interessierende Segment nach außen getragen wird.
HINWEIS: Vermeiden Sie bei diesem Schritt eine Punktion des Blinddarms oder eine Störung des mesenterialen Gefäßsystems.
- Platzieren Sie zwei Paar Pinzetten auf beiden Seiten des darunter liegenden Mesenteriums zwischen den Blutgefäßen und reiben Sie die Spitzen der Pinzette vorsichtig aneinander, um ein Loch in der Membran zu erzeugen (Abbildung 1). Dadurch kann die Nadel beim Verschluss der Bauchhöhle unter dem Darm durch das Mesenterium gelangen.
- Schließen Sie den Schnitt, während Sie die Darmschlinge nach außen tragen. Dringen Sie mit einer abgewinkelten Pinzette und einer gebogenen Nadel mit konischer Spitze, die an einer 5 cm langen Naht befestigt ist, in eine Seite des Bauchfells ein, gehen Sie durch das im vorherigen Schritt gemachte Loch und auf der anderen Seite der Bauchfellschleimhaut nach oben. Platzieren Sie eine Naht oben und eine weitere in der Nähe des unteren Randes des Schnitts.
HINWEIS: Vermeiden Sie bei diesem Schritt eine Beschädigung des Gefäßsystems.
- Wiederholen Sie diesen Vorgang, um die Haut unter der Darmschlinge zu schließen, indem Sie eine Naht in der Mitte des Schnittes zwischen den vorherigen Nähten im darunter liegenden Bauchfell platzieren.
HINWEIS: Es ist wichtig, nur den Bereich nach außen zu verlagern, der abgebildet werden soll; Dadurch werden Fremdbewegungen während der Bildgebung reduziert. Achten Sie darauf, die Mesenterialarterien nicht abzubinden.
- Verwende einen Elektrokauter, um eine Perforationslinie entlang des antimesenterialen Randes zu ziehen. Tragen Sie unmittelbar nach der Kauterisation einige Tropfen Wasser auf die Darmoberfläche auf, um zusätzliche hitzebedingte Gewebeschäden zu vermeiden. Mit einem Kimwipe abtupfen, um Restwasser zu entfernen.
- Schneiden Sie mit einer Vannas-Schere einen kleinen horizontalen Schlitz am distalen Rand des kauterisierten Gewebes und schneiden Sie entlang der Länge der kauterisierten Linie in Richtung des proximalen Endes des externalisierten Gewebesegments (ca. 1,5 cm lang), um die Schleimhautoberfläche freizulegen.
HINWEIS: Verwenden Sie bei Bedarf eine Pinzette, um überschüssigen Kotinhalt, der auf der freiliegenden Schleimhautoberfläche verbleibt, vorsichtig zu entfernen.
- Decken Sie den Bauch der Maus mit einem feuchten Kimwipe ab, um zu verhindern, dass das Gewebe austrocknet. Transportieren Sie die Maus in einem abgedeckten Gefäß zum Mikroskop.
>3. Bildaufnahme durch konfokale Spinning-Disk-Mikroskopie
- Pipettieren Sie 150 μl 1 μM AlexaFluor 633 in HBSS auf den Glasdeckel einer 35-mm-Schale. Positionieren Sie die Maus so, dass die geöffnete Schleimhautoberfläche direkt mit dem Deckglas in Kontakt kommt.
- Kippen Sie den Kopf des Mikroskops nach hinten und legen Sie die Maus auf die Deckschale auf dem Bildgebungstisch in einem vorgewärmten Inkubator. Alternativ können Sie die Maus mit einer Heizdecke abdecken, um die Körpertemperatur zu halten.
- Starten Sie die Imaging-Software. Die Anregungsintensität und die Belichtungszeit für jeden Laser sollten 10–15 mW bzw. 120–150 ms nicht überschreiten, um Photobleaching zu vermeiden und das Intervall zwischen den Zeitpunkten zu minimieren. Stellen Sie den Frame-Durchschnitt auf "2" ein und aktivieren Sie die EM-Gain-Funktion, um Hintergrundgeräusche zu reduzieren. Wählen Sie die 63-fache Objektivkalibrierung, um die korrekte Messung der Pixelgröße sicherzustellen.
HINWEIS: Die oben beschriebenen Einstellungen dienen als erste Referenz, variieren jedoch je nach individueller Mikroskopkonfiguration.
- Mit dem 405-nm-Laser und dem 20-fach-Luftobjektiv können Sie die Kerne visualisieren, um ein Feld von Zotten zu lokalisieren, die sich nicht merklich bewegen oder mit dem Auge driften. Vermeiden Sie Bereiche mit künstlichen Bewegungen aufgrund von Atmung, Peristaltik oder Herzschlag.
- Zeichnen Sie mit dem XY-Scan die XY-Koordinate des interessierenden Feldes auf und wechseln Sie zum Glycerin-Immersionsobjektiv 63X.
- Bestätigen Sie, dass die Zotten im ausgewählten Feld stabil sind, indem Sie ein Live-Bild auf dem 405-nm-Kanal für bis zu 1 Minute aufnehmen.
- Während Sie ein Live-Bild auf dem 405-nm-Kanal aufnehmen, passen Sie den Fokus so an, dass die orthogonale Ebene direkt unter der Zottenspitze gefunden wird. Erfassen Sie Z-Stapel beginnend knapp unterhalb des Zottenspitzenepithels entlang des Zottenblatts, bis es schwierig ist, die Zellkerne aufzulösen, etwa 15–20 μm, in einem 1,5-μm-Schritt.
HINWEIS: Bei der Bildgebung mit drei Kanälen (405, 488, 640 nm) unter Verwendung der oben beschriebenen Belichtungszeiten ist es möglich, alle drei Kanäle nacheinander in Abständen von ca. 20 s aufzunehmen.
- Öffnen Sie die Software 3 bis 5 Minuten nach Beginn der Aufnahme im Analysemodus, um die Bildstabilität und die γδ IEL-Motilität zu bestätigen. Nehmen Sie weiterhin 30–60 Minuten lang Bilder für jedes Zottenfeld auf. Notieren Sie 2–3 Felder für jede Maus. Überwachen Sie die Maus während des Imagings alle 5 Minuten.
