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>1. Herstellung und Charakterisierung von AMPs
HINWEIS: Um eine Kontamination zu vermeiden, stellen Sie sicher, dass alle in diesem Experiment verwendeten Materialien steril oder autoklaviert sind. Führen Sie alle Schritte bei RT in einer biologischen Sicherheitswerkbank unter sterilen Bedingungen durch, sofern nicht anders angegeben.
- Stimulation und Sammlung von Abgeordneten
- Tauen Sie ein Aliquot von 10 Millionen CEM-T-Zellen in einem 37 °C warmen Wasserbad auf. In 10 ml vorgewärmtem serumfreiem hämatopoetischem Medium wie X-VIVO in einem sterilen 15-ml-Röhrchen verdünnen und bei 200 g x 5 min zentrifugieren. Der Überstand wird aspiriert und die Zellen werden in einem vorgewärmten Medium von 5 ml resuspendiert.
- Die Zellen werden in einen T75-Gewebekulturkolben (für Suspensionszellen) mit 15 ml vorgewärmtem hämatopoetischem Medium wie X-VIVO überführt und 4 Tage lang in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubiert.
- Nach 4 Tagen werden das gesamte Nährmedium und die Zellen in einen T175-Gewebekulturkolben mit 100 ml Frischmedium überführt. Inkubieren Sie die Zellen etwa 72 Stunden lang unter den gleichen Bedingungen, bis sie auf eine Dichte von 2 Millionen Zellen/ml angewachsen sind.
- Die Zellen werden gleichmäßig auf vier T175-Kolben mit je 150 ml frischem Medium aufgeteilt und die Zellkultur fortgesetzt, bis die Zellen auf eine Dichte von 2 Millionen/ml angewachsen sind (ca. 48 Stunden Inkubation).
- Aus jedem Kolben werden Zellen durch Zentrifugation bei 200 x g für 5 min entnommen und 300 x 106 Zellen in einen neuen T175-Kolben mit 150 ml Frischmedium resuspendiert, um die Zelldichte von 2 Millionen/ml beizubehalten.
- Actinomycin D (gelöst in DMSO bei 2 mg/ml) in das Medium in einer Endkonzentration von 0,5 μg/ml geben und 24 Stunden inkubieren.
- Füllen Sie das gesamte Kulturmedium in konische 50-ml-Röhrchen und schleudern Sie die Zellen 5 Minuten lang bei 750 x g. Den Überstand in konische 50-ml-Röhrchen überführen und 15 Minuten lang bei 1.500 x g zentrifugieren, um große Zellfragmente zu entfernen.
- Den Überstand in eine 250 ml Flasche umfüllen und 50 min bei 12.000 x g ultrazentrifugieren. Den Überstand entsorgen und Pellets auffangen.
- Mit LMPs angereicherte Pellets mit 40 ml sterilem PBS in einem 50-ml-Röhrchen durch Zentrifugation bei 12.000 x g für 50 min waschen. Diesen Schritt zweimal wiederholen.
- Sammeln Sie den letzten Waschüberstand, der als Fahrzeugkontrolle verwendet wird. Suspendieren Sie die LMP-Pellets in 1 ml PBS und geben Sie sie in ein steriles 1,5-ml-Mikroröhrchen. Aliquotieren und lagern Sie isolierte LMPs bei -80 °C (um mehrere Freiauftauzyklen zu vermeiden).