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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
1. Antigen-spezifische CD8+ T-Zellen mit präparierten Nanopartikeln künstlicher Antigen-präsentierender Zellen anreichern.
- CD8+ T-Zellen isolieren.
- Euthanasieren Sie die Tiere durch Exposition gegenüber Isofluran, gefolgt von einer Gebärmutterhalsluxation.
- Entfernen Sie die Milz und die Lymphknoten von Wildtyp-Mäusen vom Typ C57BL/6j und legen Sie sie in eine PBS-Lösung. Mazerieren Sie die Organe und eluieren Sie die Zellen durch ein steriles 70-μm-Zellsieb mit häufigem Waschen von PBS.
- Um Nicht-CD8+ T-Zellen zu eliminieren, verwenden Sie ein berührungsloses CD8+ T-Zell-Isolationskit und befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers.
HINWEIS: Für jede Antigenbedingung sind mindestens 3 x 106 CD8+ T-Zellen erforderlich.
- Fügen Sie die Nanopartikel aAPCs hinzu, um an die CD8+ T-Zellen zu binden.
- Nach der Isolierung auf ein Volumen von 100 μl in PBS mit 0,5 % Rinderserumalbumin (BSA) und 2 mM EDTA konzentrieren.
- Bestimmen Sie die Anzahl der hinzuzufügenden aAPCs, indem Sie auf der Grundlage des Verhältnisses von 1011 aAPC-gebundenen, peptidbeladenen MHC-Ig-Zellen pro 106 CD8+ T-Zellen berechnen.
- Inkubieren Sie aAPC-Partikel und CD8+ T-Zellen für 1 h bei 4 °C mit kontinuierlichem Mischen in einem sterilen 5-ml-Polystyrol-Rundbodenröhrchen.
- Bereiten Sie ergänzte Medien und T-Zell-Wachstumsfaktor (TCGF) vor, um CD8+ T-Zellen zu eluieren und zu kultivieren.
- Für supplementierte Medien ergänzen Sie komplette RPMI 1640-Medien (mit Glutamin) mit 1x nicht-essentiellen Aminosäuren, 1 mM Natriumpyruvat, 0,4x Vitaminlösung, 92 μM 2-Mercaptoethanol, 10 μM Ciprofloxacin und 10 % fötalem Rinderserum (FBS).
- Um TCGF zu erstellen, befolgen Sie die etablierten Protokolle.
Anmerkung: TCGF ist ein hauseigener Cocktail aus humanen Immunzytokinen, der unerlässlich ist, um T-Zellen mit zusätzlichen Stimulationssignalen zu versorgen, die sie für ihr Wachstum benötigen. TCGF könnte gegen bekannte T-Zell-stimulierende Zytokine wie IL-2, IL-7 oder IL-15 ausgetauscht werden; jede kann jedoch die T-Zell-Antwort entsprechend polarisieren.
- aAPC und CD8+ T-Zellgemisch waschen und anreichern.
- Waschen Sie die magnetischen Partikel-aAPCs, zuerst mit dem PBS-Puffer mit 0,5 % BSA und 2 mM EDTA, dann mit supplementierten Medien und drittens mit supplementierten Medien mit 1 % TCGF.
- Eluieren Sie aAPCs und angereicherte CD8+ T-Zellen in 500 μl supplementierten Medien mit 1% TCGF.
- Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und einer Platte in einer Platte mit 96 μl Boden in 160 μl pro Vertiefung ergänzter Medien mit 1 % TCGF bei einer Konzentration von 2,5 x 105 CD8+ T-Zellen/ml.
- Wenn Sie mit aAPCs isolieren, die nur peptidbeladenes MHC-Ig auf der Oberfläche haben (keine co-stimulatorischen Signale), führen Sie Schritt 4.5 durch. Wenn Sie mit aAPCs isolieren, die sowohl peptidbeladenes MHC-Ig auf der Oberfläche als auch co-stimulatorische Signale enthalten, fahren Sie mit Schritt 5 fort.
- Fügen Sie die magnetischen Partikel, die mit co-stimulatorischen Signalen auf der Oberfläche beschichtet sind, zur angereicherten Fraktion hinzu und fügen Sie ein Magnetfeld hinzu, um die stimulierenden Signale auf der Oberfläche der T-Zellen zu co-clustern.
- Zu den angereicherten Fraktionen fügen Sie einen äquimolaren (oder größeren, je nach Anwendung - siehe Abschnitt über die zu kontrollierenden aAPC-Eigenschaften) stimulierenden Antikörper zur Anzahl der peptidbeladenen MHC-Ig-Antikörper auf dem Partikel hinzu.
- Lassen Sie co-stimulatorische magnetische Partikel 1 h bei 4 °C an angereicherte CD8+ T-Zellen binden.
- Fügen Sie ein Magnetfeld hinzu, indem Sie die Kulturplatte zwischen zwei Neodym-N52-Scheibenmagneten mit einer Länge von 1,9 cm (0,75 Zoll) platzieren.
Anmerkung: N52 Scheibenmagnete haben ein extrem starkes Feld. Es sollte darauf geachtet werden, beide mit Abstandshaltern zwischen den Magneten zu lagern, da es schwierig ist, sie voneinander zu entfernen, wenn sie auf die Kulturplatten gelegt werden. Um zu minimieren, dass die Magnete an den Metallkomponenten des Inkubators haften, platzieren Sie sie in konischen 50-ml-Styroporbehältern sowohl am Boden als auch an der Oberseite.
>2. Antigen-spezifische CD8+ T-Zellen mit präparierten Nanopartikeln künstlicher Antigen-präsentierender Zellen erweitern und
nachweisen
- Geben Sie die 96 U-Boden-Well-Platte mit aAPCs und CD8+ T-Zellen für 3 Tage in einen befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2 und 37 °C. Füttern Sie die Zellen an Tag 3 mit 80 μL pro Vertiefung des supplementierten Mediums mit 2 % TCGF und legen Sie sie bis zum 7. Tag wieder in den Inkubator.
- Ernten Sie die stimulierten Zellen an Tag 7 zur Zählung in ein 5-ml-Röhrchen mit rundem Boden.
- Sobald die gesamte Lösung geerntet ist, schleudern Sie die geernteten Zellen herunter, um in 0,5 ml PBS mit 0,05 % Natriumazid und 2 % FBS zu resuspendieren. Zählen Sie lebensfähige Zellen, indem Sie mit Trypanblau färben und auf einem Hämozytometer zählen.
- Entnehmen Sie 50.000 bis 500.000 gezählte Zellen in zwei neue 5-ml-Röhrchen mit rundem Boden für die antigenspezifische Färbung. Ein Röhrchen wird für die Färbung des verwandten Peptids und MHC verwendet, und das andere Röhrchen wird für die Färbung ohne Verwandte verwendet, um die Hintergrundfärbung zu bestimmen.
- 1 μg biotinyliertes MHC-Ig in die entsprechenden verwandten und nicht-verwandten Röhrchen in 100 μl PBS mit 0,05 % Natriumazid und 2 % FBS mit Allophycocyanin (APC)-konjugiertem Ratten-Anti-Maus-CD8a, Klon 53-6,7 (Verdünnungsverhältnis 1:100) für 1 h bei 4 °C geben.
- Fügen Sie sekundäres Streptavidin und lebenden toten Fleck hinzu. Überschüssiges biotinyliertes MHC-Ig mit PBS durch Zentrifugation auswaschen. Anschließend werden alle Proben 15 Minuten lang bei 4 °C mit einem Verhältnis von Phycoerythrin (PE)-markiertem Streptavidin und einem Verhältnis von 1:1000 von einem lebend/tot fixierbaren grünen Totkörperfleck gefärbt
.
- Lesen Sie alle Proben auf einem Durchflusszytometer ab, um die Spezifität und die Anzahl der antigenspezifischen Zellen zu bestimmen.
- Überschüssige Sekundär- und lebende/tote Flecken durch Zentrifugation auswaschen und mit 150 μl PBS-Puffer mit 0,05 % Natriumazid und 2 % FBS resuspendieren, um sie auf einem Durchflusszytometer abzulesen.
- Bestimmen Sie die Anzahl und den Prozentsatz antigenspezifischer Zellen mit einer Datenanalysesoftware.
- Um den prozentualen Anteil antigenspezifischer Zellen zu bestimmen, verwenden Sie die folgenden Gates in der jeweiligen Reihenfolge live+, lymphocyte+ (forward scatter by side scatter), CD8+ und Dimer+. Bestimmen Sie den Dimer+-Anschnitt, indem Sie den nicht verwandten Fleck mit dem verwandten Fleck vergleichen.
- Bestimmen Sie den Prozentsatz antigenspezifischer Zellen in einer Probe, indem Sie den Prozentsatz von Dimer+ des verwandten MHC-Ig-Farbstoffs vom nicht-verwandten MHC-Ig-Farbstoff subtrahieren.
- Multiplizieren Sie diesen Prozentsatz an antigenspezifischen Zellen mit der Anzahl der gezählten Zellen, um die Anzahl der antigenspezifischen Zellen zu erhalten, die sich aus der Anreicherung und Expansion ergeben.
Anmerkung: Die Kompensation muss am Durchflusszytometer eingerichtet werden, da es eine spektrale Überlappung mit den in diesem Panel verwendeten Fluorophoren gibt.