Eine Technik zur Isolierung primärer Mastzellen aus einer Peritonealhöhle der Maus

Zusammenfassung

Quelle: Tsvilovskyy, V., et al. Isolierung von Peritoneum-abgeleiteten Mastzellen und ihre funktionelle Charakterisierung mit Ca²⁺-Bildgebung und Degranulationsassays. J. Vis. Exp. (2018).

Dieses Video zeigt eine Peritonealspülungsmethode zur Isolierung reifer Bindegewebs-Mastzellen aus der Bauchhöhle erwachsener Mäuse. Nach der Isolierung einer Mischung aus primären Immunzellen aus der Bauchhöhle erfolgt die selektive Proliferation von Mastzellen unter geeigneten Kulturbedingungen.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

1. PMC-Isolierung durch intraperitoneale Lavage

1. Bereiten Sie vor der Zellisolierung die in Tabelle 1 aufgeführten Materialien vor.
2. Verwenden Sie 8 bis 14 Wochen alte männliche Mäuse für die PMC-Isolierung. Euthanasieren Sie eine Maus durch Einatmen von CO₂ und bestätigen Sie den Tod durch Verlust der Reflexe. Besprühen Sie die Maus mit 70% Ethanol und befestigen Sie sie mit Stecknadeln (mit der Rückenseite nach unten) auf einem Schaumstoffblock. Entfernen Sie die Bauchhaut der Maus mit einer stumpfen Schere. Vermeiden Sie eine Beschädigung der Bauchhöhle.
   Anmerkung: Wir verwenden dieses Protokoll typischerweise für Mäuse mit einem genetischen Hintergrund des C57BL/6N-Stammes.
3. Injizieren Sie 7 ml des eiskalten RPMI-Mediums und 5 ml Luft in die Bauchhöhle mit einer 10-ml-Spritze, die mit einer 27-G-Nadel ausgestattet ist. Schieben Sie die Nadel vorsichtig in das Bauchfell und perforieren Sie keine Organe. Verwenden Sie einen Fleck im Bereich des Nebenhodenfetts, um das Risiko einer Organperforation zu verringern.
4. Schütteln Sie die Maus nach der Injektion 1 Minute lang, um die Peritonealzellen in das RPMI-Medium zu lösen. Schütteln Sie die Maus nicht zu stark, um eine Schädigung der inneren Organe und eine Verunreinigung der Bauchhöhle mit dem Blut zu vermeiden.
5. Verwenden Sie die 10-ml-Spritze wieder, indem Sie sie mit einer neuen 20-G-Kanüle ausstatten. Verschieben Sie die inneren Organe auf eine Seite, indem Sie den Schaumstoffblock kippen und vorsichtig auf die Bank klopfen, um die Absaugung des Mediums von der anderen Seite aus zu erleichtern. Führen Sie eine 20-G-Nadel ein, schrägen Sie sie ab und saugen Sie die Flüssigkeit sanft und langsam (~0,5 mL/s) aus dem Bauch ab, um eine Verstopfung der inneren Organe zu vermeiden. Sammeln Sie so viel Flüssigkeit wie möglich (typischerweise 5–6 ml).
6. Entfernen Sie die Nadel von der Spritze und geben Sie die gesammelte Zellsuspension in ein Sammelröhrchen auf Eis. Entsorgen Sie ein Probenröhrchen, wenn eine sichtbare Blutkontamination vorliegt.
7. Zentrifugieren Sie die Röhrchen mit der Küvettensuspension bei ~300 x g für 5 min. Unter einer sterilen Haube wird der Überstand abgesaugt. Mischen Sie die Probenpellets für jede Maus in 4 mL kaltem (4–10 °C) PMC-Medium und geben Sie die Zellsuspension in einen 25 cm² Kulturkolben. Fügen Sie die Wachstumsfaktoren IL-3 und SCF zu den Endkonzentrationen von 10 ng/ml bzw. 30 ng/ml hinzu. Den Kolben mit den Zellen in einen Inkubator (37 °C und 5 % CO₂) stellen und ~48 h bis zum nächsten Eingriff inkubieren.

Tabelle 1: Materialien für Schritt 1.

1	Eis
arabische Ziffer	10 mL Spritzen
3	27 G Nadeln
4	20 G Nadeln
5	Styroporblock und Stifte
6	Entnahmeröhrchen (50 mL Zentrifugenröhrchen aus Kunststoff)
7	70% Ethanol
8	RPMI Medium (vorgekühlt und auf Eis aufbewahrt)
9	PMC Medium: RPMI Medium + 20% FCS (Fötales Kälberserum) + 1% Penicillin Streptomycin Lösung (Pen-Streptomycin Lösung)
10	Dulbecco-phosphatgepufferte Kochsalzlösung - DPBS (ohne Ca2+ und Mg2+)
11	Kulturflaschen (25 cm)
12	Wachstumsfaktoren Stammlösungen (IL-3: 1 μg/μL; SCF: 2,5 μg/ml)
13	Serologische Pipetten (10 mL)
14	Pipettenspitzen steril (20–200 μL)
Nr. 15	Hämozytometer
16	Tisch-Zentrifuge
17	Schere und Pinzette
18	CO2 -Kammer für Mäuse
19	Offene sterile Haube
20	Geschlossene sterile Haube
21	Zell-Inkubator (37 °C und 5 % CO2)
22	Transferpipetten (20–200 μL)

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
RPMI Mittel	Thermo Scientific	21875034
DPBS (Englisch)	Sigma-Aldrich	14190144
Fcs	Thermo Scientific	Nr. R92157
IL-3	F&E-Systeme	Artikel-Nr. 403-ML
Scf	Thermo Scientific	PMC2115
Penstrep	Thermo Scientific	15140122
Kulturflaschen (25 cm)	Greiner Bio-One	Artikel-Nr.: 69160
15 mL Zentrifugenröhrchen aus Kunststoff	Sarstedt	6,25,54,502
Tisch-Zentrifuge	Heraeus	Megafuge 1.0R

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