Alle Eingriffe mit menschlichen Teilnehmern wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für das Wohlergehen des Menschen durchgeführt und vom lokalen institutionellen Prüfungsausschuss überprüft.
>1. Geräteherstellung und weiche Lithographie
HINWEIS: Standard-Softlithographie-Techniken wurden verwendet, um den Mikrokanal Polydimethylsiloxan (PDMS) zu erzeugen.
- Mischen Sie den PDMS-Vorläufer im Verhältnis 10:1 aus Base und Härter.
- Gießen Sie 30 g der PDMS-Vorläufermischung in die mikrobearbeitete Aluminiumform (Abmessungen siehe Abbildung 1) und 20 g der PDMS-Vorläufermischung in die 100 mm Petrischale.
Anmerkung: Die Petrischale wird verwendet, um den dicken Film aus PDMS (~3 mm) für die Stützschicht herzustellen. Die Stützschicht aus PDMS sorgt für gleichmäßige physikalische Oberflächeneigenschaften in der gesamten Mikrofluidik. Alternativ kann eine dünne PDMS-Folie auf dem Glasobjektträger verwendet werden. Die Urform mit spezifischen Kanalabmessungen wurde durch Mikrofräsen auf dem Aluminiumblech konstruiert und gefertigt. Der in dieser Studie verwendete Spiralkanal war ein spiralförmiger Mikrokanal mit 8 Schleifen und einem Einlass und zwei Auslässen, wobei der Radius von 8 mm auf 24 mm vergrößert wurde, um eine effiziente größenbasierte Trennung zu ermöglichen.
- Stellen Sie die Form und die Petrischale in einen Vakuum-Exsikkator, um zu entgasen, bis keine Blasen mehr auf der Oberfläche sichtbar sind, normalerweise 5 - 10 Minuten. Verwenden Sie ein Hausvakuum für den Exsikkator.
- Lassen Sie das Vakuum los und stellen Sie die Form und die Petrischale für 1 h.
in einen 90 °C Ofen
Anmerkung: Anstelle eines Backofens kann eine Kochplatte oder andere Heizgeräte verwendet werden.
- Die Form und die Petrischale aus dem Ofen nehmen und 10 min bei Raumtemperatur abkühlen lassen.
- Schneiden Sie den Umriss vorsichtig aus und stanzen Sie die Löcher für den Flüssigkeitszugang mit einem 2-mm-Locher auf das Gerät.
Anmerkung: Die Größe des Stempels kann je nach Größe des Schlauchs oder der Flüssigkeitsführung variieren.
- Kleben Sie ein Klebeband und eine dicke Schicht PDMS auf die Kanalseite des Geräts und ziehen Sie es vorsichtig mit einer Pinzette ab, um Staub zu entfernen.
- Behandeln Sie sowohl die Kanalseite des Geräts als auch das einfache PDMS mit Luftplasma und verbinden Sie sich mit der vorbereiteten Stützschicht aus einfachem PDMS (Abbildung 1A).
- Legen Sie den Chip auf den 50 mm x 70 mm großen Glasschieber und legen Sie ihn für mindestens 30 Minuten in einen 70 °C Ofen, um die Haftfestigkeit zu erhöhen.
>2. Entnahme von Trachealsekret von mechanisch beatmeten Patienten
HINWEIS: Trachealsekrete können von mechanisch beatmeten Patienten während der normalen routinemäßigen Atemwegsversorgung gewonnen werden, indem ein Protokoll verwendet wird, das von herkömmlichen Methoden modifiziert wurde, um den standardmäßigen, erwachsenen beatmeten Patienten aufzunehmen. Die Proben wurden anonymisiert und sofort zur Verarbeitung geschickt.
- Wenn eine Trachealaspiration indiziert ist, verwenden Sie einen Katheter, um Atemwegssekrete zu extrahieren.
- Führen Sie den Katheter vorsichtig zur Hälfte in den Endotrachealtubus ein und träufeln Sie 5 ml 0,9 % sterile normale Kochsalzlösung aus einer vorgefüllten 10-ml-Spritze.
- Wenn der Katheter vollständig vorgeschoben ist oder ein Widerstand erreicht ist, aspirieren Sie die Sekrete und sammeln sie in einem sterilen Sputumauffangbehälter.
- Sammeln Sie 10 ml Trachealsekrete in einem sterilen Sputumbehälter und legen Sie ihn auf Eis. Senden Sie die Proben sofort zur Verarbeitung.
>3. Probenvorbereitung für Trachealsekret
HINWEIS: Alle Experimente müssen unter einer Biosicherheitswerkbank mit der richtigen persönlichen Schutzausrüstung durchgeführt werden.
- Dispergieren Sie 1 ml Atemwegssekretproben in 9 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit einer 10-ml-Kunststoffspritze (für eine 10-fache Verdünnung). Verwenden Sie eine stumpfe Pipette, um die Schleimprobe zu homogenisieren.
- Siehen Sie das Verdünnungsmittel mit einem 40 μm Nylon-Zellsieb ab, um große Brocken oder Blutgerinnsel zu entfernen, die das Zugangsloch zur Mikrofluidik oder den Kanal blockieren können. Legen Sie die Probe nach der Verarbeitung auf das Eis.
- Dispergieren Sie das Verdünnungsmittel jeder Probe mit einem 100-fachen Volumen PBS-Puffer, was zu einer 1.000-fach verdünnten Suspension führt. Legen Sie die Probe während des gesamten Dissoziationsvorgangs auf das Eis.
>4. Versuchsaufbau
HINWEIS: Alle Experimente müssen unter einer Biosicherheitswerkbank mit der richtigen persönlichen Schutzausrüstung durchgeführt werden.
- Montieren Sie den PDMS-Chip mit der Flüssigkeitsführung, um eine gleichmäßige Strömung auf jeden der vier spiralförmigen Mikrokanäle anzuwenden (Abbildung 1B).
Anmerkung: Vier Kanäle wurden verwendet, um den Durchsatz durch Parallelisierung zu erhöhen, sowie das Volumen und die Zelldichte der resultierenden Suspension zu optimieren. Die Strömungsführung wird mit einem Stereolithographie-3D-Drucker mit klarem Harz entworfen und hergestellt. Der Einlass und der Auslass der Flüssigkeitsführung sind mit weiblichen Luer-Anschlüssen ausgestattet, um den Anschluss zu erleichtern und während des Betriebs stabil abzudichten.
- Schließen Sie einen 1/16-Zoll-Luer-Stecker an den Einlass, den Innenwandauslass (IW) und den Auslassanschluss an der Außenwand (OW) der Flüssigkeitsführung an und verbinden Sie einen Silikonschlauch mit der Probensuspension.
- Führen Sie stumpfe Spitzen an jedem Ende des Einlasses und der Auslässe ein, um den Boden des Probenbehälters zu erreichen.
- Verbinden Sie die Schlauchpumpe mit dem Einlassschlauch.
- Legen Sie das Ende des Einlassschlauchs und des IW-Auslassschlauchs in den Probenbehälter und legen Sie das Ende des OW-Auslassschlauchs in den Abfallbehälter (Abbildung 1C, D).
- Legen Sie das 50-ml-Röhrchen mit gefiltertem PBS ohne Calcium und Magnesium in das Probenreservoir.
- Beginnen Sie mit dem Pumpen bei einer niedrigen Durchflussrate (~1 ml/min), um das Gerät anzusaugen.
Anmerkung: Wenn Blasen im Kanal gefangen sind, drücken Sie mit der Pinzette auf die Oberseite des Kanals, um Luftblasen zu destabilisieren und zu beseitigen. Wenn das Gerät vollständig mit Pufferlösung gefüllt ist, wechseln Sie das PBS-Röhrchen, um das Probenröhrchen für die Atemwegssekretion vorzubereiten.
- Wenn die Probe in das Probenreservoir gegeben wird, schalten Sie die Peristaltikpumpe ein und stellen Sie die Durchflussrate auf 4 mL/min ein (Abbildung 1C, D).
- Wenn das Probenvolumen das angegebene Volumen (~1 ml) erreicht, stoppen Sie den Vorgang und trennen Sie den Silikonschlauch.
Anmerkung: Die vorgeschlagene Methode ist effizienter bei der Zerkleinerung eines großen Volumens an Verdünnungsmittel (>50 mL) in ein Volumen eines Mikrozentrifugenröhrchens (~1 mL) (Abbildung 2).
