Markierung von murinen T-Helper-Lymphozyten mit radioaktiv markierten monoklonalen Antikörpern

Zusammenfassung

Quelle: Hoffmann, S. H. L., et al., Maus Lymphozytenmarkierung durch ⁶⁴Cu-Antikörper-Rezeptor-Targeting für den In-vivo-Zelltransport durch PET/CT. J. Vis. Exp. (2017)

In diesem Video demonstrieren wir die intrazelluläre Radiomarkierung von T-Helferzellen unter Verwendung von radioaktiven Isotopen-konjugierten monoklonalen Antikörpern für die nicht-invasive Positronen-Emissions-Tomographie-Bildgebung.

Protokoll

>1. cOVA-TH1 Zell-Radiomarkierung

HINWEIS: Die ⁶⁴Cu-DOTA-KJ1-26-mAb werden auf kultivierte cOVA-TH1-Zellen angewendet, um eine intrazelluläre radioaktive Markierung zu ermöglichen.

1. Für die Radiomarkierung von cOVA-TH1-Zellen werden 37 MBq der radioaktiv markierten ⁶⁴Cu-DOTA-KJ1-26-mAb in einer Spritze ohne Totvolumen unter Verwendung eines Dosiskalibrators entnommen. Fügen Sie 1 mL Kochsalzlösung hinzu, um eine Lösung mit 37 MBq/mL zu erhalten.
2. Suspendieren Sie cOVA-TH1-Zellen im Medium bei 2 x 10⁶ Zellen/ml und geben Sie 0,5 ml der Zellsuspension in jede Vertiefung in einer 48-Well-Platte.
3. Geben Sie 20 μl der frisch zubereiteten 37 MBq/ml ⁶⁴Cu-DOTA-KJ1-26-mAb-Lösung in jede Vertiefung der 48-Well-Platte. Das endgültige Verhältnis für die Markierung beträgt 0,7 MBq pro 10⁶ Zellen in einem Volumen von 520 μl. Inkubieren Sie bei 37 °C und 7,5 % CO₂ für 30 min.
4. Nach der Inkubation resuspendieren Sie die Zellen vorsichtig in jedem Well und überführen Sie die Zellsuspension von der 48-Well-Platte in ein 50-ml-Schraubverschlussröhrchen. Um den Zellverlust zu minimieren, spülen Sie jede Vertiefung mit einem vorgewärmten Medium aus.
5. Zentrifugieren Sie die cOVA-TH1-Zellsuspension bei 400 x g für 5 Minuten, verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 10 mL vorgewärmtem PBS. Für die Zellzählung wird ein Aliquot der Zellsuspension entnommen. Wiederholen Sie den Waschschritt.
6. Zählen Sie lebensfähige cOVA-TH1-Zellen in einer geeigneten Verdünnung mit Trypanblau-Färbung.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
64Cu Aufarbeitungsmodul	WKL	Sonderanfertigung	64Cu Produktion
Dosis-Kalibrator	Capintec	SFB-25R
PETtrace Zyklotron	Medizinische Systeme von General Electric
DOTA-NHS	Makrozyklik	B-280
Anti-cOVA-TCR-Antikörper (KJ1-26)		Isoliert aus Hybridom-Zellkultur	DOTA-Konjugation
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	Artikel-Nr.: 71633	DOTA-Konjugation
H+ Chelex 100	Sigma-Aldrich	Nr. C7901	DOTA-Konjugation
Amicon Ultra-15 Filtereinheit	Merck Millipore	UFC910008	DOTA-Konjugation
Rotipuran Reinstwasser	Carl Roth	HN68.3	DOTA-Konjugation
Ammoniumacetat	Sigma-Aldrich	Artikel-Nr.: 32301	DOTA-Konjugation
Pbs	Universität Tübingen		DOTA-Konjugation
Micro Bio-spin P-6 Säule	Bio-Rad Laboratorien	7326221	DOTA-Konjugation
Natriumcitrat	Sigma-Aldrich	Artikel-Nr.: 71497	DOTA-Konjugation
Cyclone Plus PhosphorImager	Perkin-Elmer	L2250116	DOTA-Konjugation
DMEM	Merck Millipore	102568	Zutat für T-Zell-Medium
Fcs	Merck Millipore	Nr. S0115/1004B	Zutat für T-Zell-Medium
Natriumpyruvat	Merck Millipore	Nr. L0473	Zutat für T-Zell-Medium
MEM-Aminosäuren	Merck Millipore	Nr. K0293	Zutat für T-Zell-Medium
HEPES	Merck Millipore	L 1613	Zutat für T-Zell-Medium
Penicillin/Streptomycin	Merck Millipore	Nr. A2212	Zutat für T-Zell-Medium
0,05 mM 2-β-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	Nr. M3148	Zutat für T-Zell-Medium
DO11.10 Mäuse		Eigenzucht	TH1-Zellkultur
DPBS (Englisch)	Gibco	14190144	TH1-Zellkultur
Zellsieb 40 μm	Corning	Artikel-Nr.: 352340	TH1-Zellkultur
ACK Lysing-Puffer	Lonza	10-548E	TH1-Zellkultur
CD4 MicroBeads, Maus	Miltenyi Biotech	Tel.: 130-097-145	TH1-Zellkultur
QuadroMACS-Trennzeichen	Miltenyi Biotech	Tel.: 130-090-976	TH1-Zellkultur
LS-Säule	Miltenyi Biotech	Tel.: 130-042-401	TH1-Zellkultur
Anti-CD4-Antikörper (Gk1.5)		Isoliert aus Hybridom-Zellkultur	TH1-Zellkultur
Anti-CD8-Antikörper (5367.2)		Isoliert aus Hybridom-Zellkultur	TH1-Zellkultur
Anti-Ratten-Antikörper (MAR18,5)		Isoliert aus Hybridom-Zellkultur	TH1-Zellkultur
Kaninchen-Komplementär MA	tebu-Bio	Nr. CL3221	TH1-Zellkultur
Anti-IL-4-Antikörper (11B11)		Isoliert aus Hybridom-Zellkultur	TH1-Zellkultur
cOVA 323-339-Peptid	EMV-Mikro-Sammlungen	Sonderanfertigung	TH1-Zellkultur
CPG1668-Oligonukleotide	Eurofins MWG Operon	Sonderanfertigung	TH1-Zellkultur
IL-2	Novartis	Artikel-Nr.: 65483-116-07	TH1-Zellkultur
96-Well-Platten	Greiner	Artikel-Nr.: 655180	TH1-Zellkultur
24-Well-Platten	Greiner	Artikel-Nr.: 662160	TH1-Zellkultur
Zellkulturflasche	Greiner	660175	TH1-Zellkultur
48-Well-Platten	Greiner	677 180	Beschriftung von Zellen
Gammacell 1000	Beste Theratronik	Über Anfrage
Gulmay RT225	Gulmay	Über Anfrage
Trypan-Blau	Merck Millipore	Nr. L6323	In-vitro-Bewertung

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