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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Reagenzien- und Materialvorbereitung
- Bereiten Sie 500 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) vor, die 2 % fötales Rinderserum (FBS) und 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) enthält.
Anmerkung: Halten Sie den Puffer während des gesamten Eingriffs auf Eis, um optimale Ergebnisse zu erzielen.
- Bereiten Sie 50 ml vollständiges RPMI-Medium vor, das RPMI 1640, 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin enthält. Verwenden Sie komplette RPMI-Medien mit 50 μM β-Mercaptoethanol für die Differenzierung der THGM-Zelle. Geben Sie das β-Mercaptoethanol in einen Abzug.
- Bereiten Sie 7,5 ml einer Anti-CD3e-Antikörpermischung vor, indem Sie konzentriertes Anti-CD3e-Stammmaterial in PBS auf 3 μg/ml verdünnen. Beschichten Sie 48-Well-Platten, indem Sie 150 μl der Antikörpermischung in jede Vertiefung geben und die Platte mindestens 1 h lang bei 37 °C oder über Nacht bei 4 °C inkubieren.
- Sterilisieren Sie eine Schere und eine Pinzette und bewahren Sie sie zwischen den Sektionen in 70%igem Ethanol auf.
>2. Präparation von murinen Splenozyten
- Euthanasieren Sie die Maus (6–8 Wochen alt) mit einer institutionell zugelassenen CO2 -Erstickung oder Gebärmutterhalsluxation. Besprühen Sie die Maus mit 70% Ethanol und montieren Sie sie auf einen Styroporblock auf der Rückseite. Bringen Sie die Maus in eine biologische Sicherheitswerkbank, um mit den folgenden Schritten fortzufahren.
- Halten Sie die Haut mit einer Pinzette fest und schneiden Sie die Haut unterhalb des Brustkorbs auf der linken Seite mit einer Schere ca. 4 cm ein. Öffnen Sie den Bauchfellsack, um die Milz freizulegen, und verwenden Sie eine sterile Pinzette, um die Milz zu extrahieren.
- Legen Sie ein 70-μm-Zellsieb auf ein 50-ml-Röhrchen und befeuchten Sie es mit 2 mL Puffer. Legen Sie die Milz auf das Zellsieb (2–3 Milz für ein Zellsieb) und mazerieren Sie sie mit dem Ende eines 5-ml-Spritzenkolbens.
- Spülen Sie das Sieb und das Röhrchen mehrmals mit 1–2 mL Zellisolationspuffer, bis alle Zellen in das Röhrchen gespült sind. Das Zellsieb verwerfen und die Zellen bei 350 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Den Überstand verwerfen.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet mit 5 mL kaltem (4 °C) Ammoniumchlorid-Kalium (ACK) Lysingpuffer (150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM Na2EDTA; pH 7,2–7,4) und mischen Sie sie vorsichtig für 2 min. Fügen Sie 10 mL vollständiges RPMI-Medium hinzu, um den ACK-Puffer zu neutralisieren, und zentrifugieren Sie die Zellen sofort bei 350 x g für 5 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand nach der Zentrifugation.
>3. Isolierung von CD4+ T-Zellen mit magnetischen CD4-Mikrokügelchen und einer Zelltrennsäule
- Resuspendieren Sie das Zellpellet in 5 mL Zellisolationspuffer. Filtrieren Sie die Zellsuspension mit einem Vorabscheidungsfilter (30 μm) in ein neues 15-ml-Röhrchen, um Schmutz zu entfernen.
- Nehmen Sie 10 μl der Zellsuspension und verdünnen Sie sie 10x mit 90 μl des Puffers. Nehmen Sie 10 μl der verdünnten Zellsuspension und mischen Sie sie mit 10 μl Trypanblau für die Zellzählung. Zählen Sie die Zellen in einem Hämozytometer, um die Ausbeute an lebensfähigen Zellen zu bestimmen.
- Die Zellen werden bei 350 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert und der Überstand verworfen.
- Resuspendieren Sie die Zellen in 90 μl Puffer pro 107 Zellen. Fügen Sie 10 μl magnetische CD4-Mikrokügelchen pro 107 Zellen hinzu. Inkubieren Sie die Zellen 15 Minuten lang bei 4 °C. Für optimale Ergebnisse mischen Sie die Zellsuspension während der Inkubation alle 5 Minuten vorsichtig.
- Während die Zellen inkubieren, stellen Sie eine Trennsäule auf den Magnetständer. Befeuchten Sie die Säule mit 2 mL Puffer
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- Am Ende der Küvetten-/Kügelcheninkubation werden die Zellen mit 5 mL Puffer gewaschen und bei 350 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen.
- Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml Puffer, laden Sie die Probe in die Zelltrennsäule und lassen Sie sie durchströmen. Verwenden Sie ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen, um die CD4-Zellfraktion zu sammeln. Fügen Sie 1 ml Puffer hinzu, um das Reservoir zu waschen, bevor es trocken ist. Wiederholen Sie den Waschschritt 2x.
- Nehmen Sie die Zelltrennsäule vom Magnetständer und setzen Sie sie auf ein neues 15-mL-Zentrifugenröhrchen. Geben Sie 2 ml Zellisolationspuffer in die Zelltrennsäule und setzen Sie den Kolben fest an, um die Zellen aus der Säule zu drücken.
- Die Fraktion wird bei 350 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert, um CD4+-Zellen zu erhalten. Entsorgen Sie den Überstand.
>4. Aufreinigung der naiven CD4+ T-Zellen (CD4+CD25-CD44loCD62Lhi) durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung und THGM Differenzierung
- Resuspendieren Sie das erhaltene CD4+-Zellpellet in 500 μl Puffer. Mischen Sie die Zellen mit einer fluoreszierend-konjugierten Antikörpermischung, die CD4-PerCp (2,8 μg/ml), CD44-APC (2,4 μg/ml), CD25-PE (2 μg/ml) und CD62L-FITC (10 μg/ml) enthält (Tabelle 1). Inkubieren Sie die Zellen 20–30 Minuten lang auf Eis und schützen Sie sie dabei vor Licht.
Anmerkung: Die Konzentrationen der Antikörper wurden zuvor im Labor optimiert. Die angegebene Anzahl von Antikörpern bezieht sich auf Zellen von 1–2 Mäusen.
- Waschen Sie die Zellen nach der Inkubation mit 5 mL Puffer und zentrifugieren Sie die Zellen bei 350 x g für 5 min bei 4 °C.
- Den Überstand verwerfen und die Zellen in 500 μl Puffer resuspendieren. Filtern Sie die Zellen erneut mit einem Nylonnetz.
- Übertragen Sie die Zellsuspension zur Zellsortierung in ein FACS-Röhrchen. Die Sammel-FACS-Röhrchen mit 500 μl Puffer beschichten.
- Erhält man eine CD4+CD25-CD44loCD62Lhi-Population (von naiven CD4+ T-Zellen) durch FACS-Sortierung. Gattern Sie zuerst auf CD4+CD25- und wählen Sie dann CD44loCD62L-Hi-Zellen aus dieser Population aus.
- Sammeln Sie die naiven CD4+ T-Zellfraktionen in einem neuen 15-ml-Zentrifugenröhrchen. Die Zellen werden bei 350 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert und der Überstand verworfen.
- Resuspendieren Sie die naiven CD4+ T-Zellen in einer Konzentration von 106 Zellen/ml in vollständigen RPMI-Medien, die 50 μM β-Mercaptoethanol enthalten.
- Aspirieren Sie die Anti-CD3e-Antikörper, die für die Vorbeschichtung in der 48-Well-Platte verwendet werden. Keimen Sie 0,25 Millionen (250 μl) Zellen in jeder Vertiefung mit IL-7 (2 ng/ml), Anti-CD28 (1 μg/ml) und anti-IFNγ (10 μg/ml) (Tabelle 1).
Anmerkung: Die Konzentrationen von Zytokinen und Antikörpern wurden zuvor im Labor für eine Differenzierung von TH-GM-Zellen optimiert.
- Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C mit 5 % CO2 für 3 Tage. Wechseln Sie das Medium während der Inkubation nicht.
>5. Analyse der in vitro erzeugten GM-Zellen der Maus
- Überprüfen Sie mit einem Mikroskop die Zelldifferenzierung 3 Tage nach der Differenzierung. Ernten Sie die Zellen und zentrifugieren Sie sie bei 350 x g für 5 min bei 4 °C. Waschen Sie die Zellen 2x mit kompletten RPMI-Medien.
Anmerkung: Differenzierte Zellen sind größer als naive CD4+ T-Zellen.
- Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml vollständigem RPMI-Medium. Nehmen Sie 10 μl Zellsuspension und mischen Sie diese gut mit 10 μl Trypanblau, um die Zellzahl mit einem Hämozytometer zu bestimmen. Teilen Sie die differenzierten Zellen zur Restimulation und Analyse in drei Tränke auf.
Anmerkung: Für die intrazelluläre Zytokinfärbung werden ≥0,5 Millionen Zellen benötigt.
- Für die intrazelluläre Zytokinfärbung restimulieren Sie die Zellen mit Phorbol-12-Myristat-13-acetat (PMA) (100 ng/ml) und Ionomycin (1 μg/ml) in Gegenwart eines Proteintransportinhibitors (1 μl/ml) für 4–6 h.
- Ernten Sie die Zellen und färben Sie sie 30 Minuten lang mit Anti-CD4-Antikörpern (PerCP-konjugiert, 0,2 mg/ml, 1:100 Verdünnung; oder FITC-konjugiert, 0,5 mg/ml, 1:100 Verdünnung).
- Fixieren Sie die Zellen mit 200 μl Fixierpuffer für 20–60 Minuten. Waschen Sie die Zellen nach der Fixierung 2x mit 1 mL Permeabilisierungspuffer.
- Durchführung einer intrazellulären Färbung mit Antikörpern gegen GM-CSF (PE-konjugiert, 0,2 mg/ml, 1:100 Verdünnung), IL-17A (FITC-konjugiert, 0,5 mg/ml, 1:100 Verdünnung; APC-konjugiert, 0,2 mg/ml, 1:100 Verdünnung), IL-4 (APC-konjugiert, 0,2 mg/ml, 1:100 Verdünnung) und IFNγ (APC-konjugiert, 0,2 mg/ml, 1:100 Verdünnung; PE-konjugiert, 0,2 mg/ml, 1:100 Verdünnung) für 30 min im Dunkeln.
Tabelle 1: Verwendete Zytokine und Antikörper.
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| Name | Bestandskonzentration | Arbeitsschwerpunkt | Verdünnung | Volumen in 500 μL Färbepuffer |
| CD4-PerCp | 0,2 mg/ml | 2,8 μg/ml | 1:71 | 7 μL |
| CD44-Schützenpanzer | 0,2 mg/ml | 2,4 μg/ml | 1:83 | 6 μL |
| CD25-PE | 0,2 mg/ml | 2 μg/ml | 1:100 | 5 μL |
| CD62L-FITC | 0,5 mg/ml | 10 μg/ml | 1:50 | 10 μL |
| GM-CSF-PE | 0,2 mg/ml | 2 μg/ml | 1:100 | |
| IL-17A-FITC | 0,5 mg/ml | 5 μg/ml | 1:100 | |
| IL-17A-Schützenpanzer | 0,2 mg/ml | 2 μg/ml | 1:100 | |
| IFNγ-APC | 0,2 mg/ml | 2 μg/ml | 1:100 | |
| IFNγ-PE | 0,2 mg/ml | 2 μg/ml | 1:100 | |
| IL-4-Schützenpanzer | 0,2 mg/ml | 2 μg/ml | 1:100 | |
| CD4-FITC | 0,5 mg/ml | 5 μg/ml | 1:100 | |
| IL-7 | 20 μg/ml | 2 ng/ml | 1:10000 | |
| Anti-CD28 | 0,5 mg/ml | 1 μg/ml | 1:500 | |
| Anti-IFNγ | 1 mg/ml | 10 μg/ml | 1:100 | |