Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Dissoziation des Gehirns und magnetische Mikrogliaisolierung
HINWEIS: Alle Zellmanipulationen und Resuspensionen müssen mit einer 1.000 μl Pipette mit großer Vorsicht durchgeführt werden. Die Anwendung einer hohen mechanischen Wirkung kann Mikrogliazellen aktivieren oder abtöten.
- Übertragen Sie 12 Gehirnstücke (~1,2 g) pro Dissoziationsröhrchen, das das Dissoziationsgemisch gemäß Tabelle 1 enthält. Für 24 Jungtiere werden vier C-Tubes benötigt (Abbildung 1A-B).
- Platzieren Sie C-Rohre auf dem Dissoziator (mit dem Heizmodus). Starten Sie das optimierte NTDK-Programm im Gerät gemäß den Anweisungen des Herstellers (Abbildung 1D).
- Bei 300 x g für 20 s (bei 4 °C) zentrifugieren, um alle Zellen zu sammeln. Schließen Sie die mechanische Dissoziation ab, indem Sie mit einer 1.000-μl-Pipette dreimal auf und ab pipettieren (Abbildung 1E).
- Übertragen Sie die Zellen auf vier 15 mL Röhrchen + Siebe. Spülen Sie die Siebe mit 10 mL 1x Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) mit Ca2+ und Mg2+ (HBSS+/+) (Abbildung 1F).
- Bei 300 x g für 10 min (bei 4 °C) zentrifugieren und den Überstand entfernen. Suspendieren Sie das Pellet vorsichtig mit 10 mL HBSS+/+ (Abbildung 1G).
- Bei 300 x g für 10 min (bei 4 °C) zentrifugieren und den Überstand entfernen. Das Pellet vorsichtig mit 6 mL Sortierpuffer (1x PBS + 0,5 % BSA) resuspendieren (Abbildung 1H).
- Bei 300 x g für 10 min (bei 4 °C) zentrifugieren und den Überstand entfernen. Geben Sie 200 μl CD11b-Mikrokügelchenlösung pro Röhrchen hinzu und resuspendieren Sie sie vorsichtig (Abbildung 1I).
- Die Röhrchen werden 15-20 Minuten lang bei 4 °C inkubiert. Das Pellet wird vorsichtig mit 6 ml Sortierpuffer resuspendiert (Abbildung 1I-J).
- Bei 300 x g für 10 min (bei 4 °C) zentrifugieren und den Überstand entfernen. Das Pellet vorsichtig mit 8 mL Sortierpuffer resuspendieren (Abbildung 1K).
- Befolgen Sie das POSSEL-Programm auf dem Trenner (siehe Materialtabelle), um acht Spalten vorzubereiten. Übertragen Sie Zellen 1 ml x 1 ml auf die Säule. Warten Sie, bis alle Zellen durchgegangen sind, bevor Sie einen weiteren ml hinzufügen. Eluieren Sie CD11b+-Zellen auf einer sterilen Elutionsplatte mit 1 mL Sortierpuffer (Abbildung 1L).
- Bündeln Sie CD11b+-Zellen in einem neuen 50-ml-Röhrchen (Abbildung 1M).
- Bei 300 x g für 10 min (bei 4 °C) zentrifugieren und den Überstand entfernen. Resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig mit 10 ml kaltem Mikrogliamedium (Makrophagen-serumfreies Kulturmedium (SFM) + 1 % Penicillin-Streptomycin (P/S)) (Abbildung 1N).
- Zählen Sie die CD11b+ Zellen. Bei P8 sollte man ~650.000 Zellen pro Gehirn erhalten.
Anmerkung: Im vorliegenden Protokoll wurden die Zellen mit Hilfe eines automatisierten Zellzählers gezählt (siehe Materialtabelle).
- Resuspendieren Sie die Zellen in kaltem Mikrogliamedium auf eine Endkonzentration von 650.000-700.000 Zellen/ml und geben Sie sie in Zellkulturplatten ab.
Anmerkung: Die 6-Well-Platten sind für Western Blot (2 mL pro Well); Die 12-Well-Platten sind für die RT-qPCR-Analyse (1 ml pro Well) und die 96-Well-Platten für phagozytische Assays (250 μl pro Well) vorgesehen.
Tabelle 1: Zubereitung des Dissoziationsgemisches.
kg
| Lösung | Für ein C-Rohr (μL) | Für vier C-Röhrchen (μL) |
| Puffer X | 2850 | Nr. 11400 |
| Enzym P (Papain) | 75 | 300 |
| Enzym A (DNAse) | Nr. 15 | 60 |
| Puffer Y | 30 | Nr. 120 |
| gesamt | Nr. 2970 | Nr. 11880 |
