Magnetische Isolierung von Mikroglia aus dem Gehirn von Maus-Welpen

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Dissoziation des Gehirns und magnetische Mikrogliaisolierung

HINWEIS: Alle Zellmanipulationen und Resuspensionen müssen mit einer 1.000 μl Pipette mit großer Vorsicht durchgeführt werden. Die Anwendung einer hohen mechanischen Wirkung kann Mikrogliazellen aktivieren oder abtöten.

1. Übertragen Sie 12 Gehirnstücke (~1,2 g) pro Dissoziationsröhrchen, das das Dissoziationsgemisch gemäß Tabelle 1 enthält. Für 24 Jungtiere werden vier C-Tubes benötigt (Abbildung 1A-B).
2. Platzieren Sie C-Rohre auf dem Dissoziator (mit dem Heizmodus). Starten Sie das optimierte NTDK-Programm im Gerät gemäß den Anweisungen des Herstellers (Abbildung 1D).
3. Bei 300 x g für 20 s (bei 4 °C) zentrifugieren, um alle Zellen zu sammeln. Schließen Sie die mechanische Dissoziation ab, indem Sie mit einer 1.000-μl-Pipette dreimal auf und ab pipettieren (Abbildung 1E).
4. Übertragen Sie die Zellen auf vier 15 mL Röhrchen + Siebe. Spülen Sie die Siebe mit 10 mL 1x Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) mit Ca²⁺ und Mg²⁺ (HBSS+/+) (Abbildung 1F).
5. Bei 300 x g für 10 min (bei 4 °C) zentrifugieren und den Überstand entfernen. Suspendieren Sie das Pellet vorsichtig mit 10 mL HBSS+/+ (Abbildung 1G).
6. Bei 300 x g für 10 min (bei 4 °C) zentrifugieren und den Überstand entfernen. Das Pellet vorsichtig mit 6 mL Sortierpuffer (1x PBS + 0,5 % BSA) resuspendieren (Abbildung 1H).
7. Bei 300 x g für 10 min (bei 4 °C) zentrifugieren und den Überstand entfernen. Geben Sie 200 μl CD11b-Mikrokügelchenlösung pro Röhrchen hinzu und resuspendieren Sie sie vorsichtig (Abbildung 1I).
8. Die Röhrchen werden 15-20 Minuten lang bei 4 °C inkubiert. Das Pellet wird vorsichtig mit 6 ml Sortierpuffer resuspendiert (Abbildung 1I-J).
9. Bei 300 x g für 10 min (bei 4 °C) zentrifugieren und den Überstand entfernen. Das Pellet vorsichtig mit 8 mL Sortierpuffer resuspendieren (Abbildung 1K).
10. Befolgen Sie das POSSEL-Programm auf dem Trenner (siehe Materialtabelle), um acht Spalten vorzubereiten. Übertragen Sie Zellen 1 ml x 1 ml auf die Säule. Warten Sie, bis alle Zellen durchgegangen sind, bevor Sie einen weiteren ml hinzufügen. Eluieren Sie CD11b+-Zellen auf einer sterilen Elutionsplatte mit 1 mL Sortierpuffer (Abbildung 1L).
11. Bündeln Sie CD11b+-Zellen in einem neuen 50-ml-Röhrchen (Abbildung 1M).
12. Bei 300 x g für 10 min (bei 4 °C) zentrifugieren und den Überstand entfernen. Resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig mit 10 ml kaltem Mikrogliamedium (Makrophagen-serumfreies Kulturmedium (SFM) + 1 % Penicillin-Streptomycin (P/S)) (Abbildung 1N).
13. Zählen Sie die CD11b+ Zellen. Bei P8 sollte man ~650.000 Zellen pro Gehirn erhalten.
    Anmerkung: Im vorliegenden Protokoll wurden die Zellen mit Hilfe eines automatisierten Zellzählers gezählt (siehe Materialtabelle).
14. Resuspendieren Sie die Zellen in kaltem Mikrogliamedium auf eine Endkonzentration von 650.000-700.000 Zellen/ml und geben Sie sie in Zellkulturplatten ab.
    Anmerkung: Die 6-Well-Platten sind für Western Blot (2 mL pro Well); Die 12-Well-Platten sind für die RT-qPCR-Analyse (1 ml pro Well) und die 96-Well-Platten für phagozytische Assays (250 μl pro Well) vorgesehen.

Tabelle 1: Zubereitung des Dissoziationsgemisches.

Abbildung 1: Schematische Darstellung der Dissoziationen im Gehirn und der Isolierung von Mikrogliazellen. (A-C) Nach der P8-Dissektion des Mausgehirns und der Entfernung von Geruchsbulben und Kleinhirn wurden die Gehirne zunächst in eine Petrischale mit HBSS+/+ und dann in Dissoziationsröhrchen mit dem Dissoziationsgemisch übertragen. Die C-Röhren wurden auf den Dissoziator gelegt (mit dem Heizmodus) und das NTDK-Programm wurde gestartet (D). (E) Am Ende des Programms wurden die Röhrchen bei 300 x g für 20 s bei 4 °C zentrifugiert; Die Dissoziation wurde dann durch dreimaliges Auf- und Abpipettieren mit einer 1.000-μl-Pipette abgeschlossen. (F) Die Zellen wurden dann in 15-ml-Röhrchen + Siebe mit 70 μm überführt und mit 10 ml HBSS+/+ gespült. (G) Die Proben wurden dann bei 300 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert, der Überstand wurde entfernt und das Pellet mit 10 mL HBSS+/+ resuspendiert. (H) Die Röhrchen wurden erneut bei 300 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert; Der Überstand wurde entfernt und dann das Pellet in 6 ml Sortierpuffer resuspendiert. (I) Die Röhrchen wurden bei 300 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert, der Überstand entfernt und die CD11b-Mikrokügelchenlösung (200 μl) hinzugefügt. Die Röhrchen wurden 15 bis 20 Minuten lang bei 4 °C inkubiert, dann in 6 ml Sortierpuffer (J) resuspendiert und bei 300 x g für 10 Minuten bei 4 °C zentrifugiert. (K) Der Überstand wurde entfernt und das Pellet vorsichtig in 8 ml Sortierpuffer resuspendiert. (L) Starten Sie dann das POSSEL-Programm auf dem Separator, um die Spalten vorzubereiten. Die Zellen wurden 1 ml x 1 ml auf der Säule übertragen, und CD11b-Zellen wurden auf einer sterilen Elutionsplatte mit 1 ml Sortierpuffer eluiert. (M) CD11b-Zellen wurden in ein neues 50-ml-Röhrchen gepoolt und bei 300 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert, wobei der Überstand entfernt wurde. (N) Das Pellet wurde im letzten Schritt vorsichtig in 10 mL kaltem Mikrogliamedium resuspendiert. Die Zellen wurden gezählt und im Mikrogliamedium auf eine Endkonzentration von 650.000-700.000 Zellen/ml verdünnt, die in Zellkulturplatten abgegeben wurden.