Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Intrazisternale Injektion von Mäusen
HINWEIS: Das gesamte Verfahren wird in der Laminar-Flow-Kabine durchgeführt, um aseptische Bedingungen aufrechtzuerhalten.
- Haltung von Labormäusen (8 Wochen alt, weiblicher Balb/c) unter spezifisch erregerfreien Bedingungen. Stellen Sie Futterpellets und Wasser ad libitum zur Verfügung.
- Setzen Sie die Tiere 1 Woche lang in die neue Umgebung, bevor Sie mit dem Versuch beginnen.
- Bevor Sie mit dem Experiment beginnen, wiegen und bewerten Sie ihre Körpertemperatur.
Anmerkung: Die Inzucht-weiblichen Balb/c-Mäuse im Alter von acht Wochen wiegen durchschnittlich etwa 19 g. Die Durchschnittstemperatur von Labormäusen liegt physiologisch zwischen 36 und 38 °C.
- Reinigen Sie das Tier vom Hals aus, reinigen Sie den Bauchbereich mit 70%igem Ethanol und injizieren Sie I.P. Eisendextran (gelöst in 1% Phosphat-Kochsalzlösungspuffer, 250 mg/kg) in den unteren rechten Quadranten des Mausabdomens, indem Sie eine 25-G-Nadel 0,5 mm x 16 mm verwenden, etwa 2-3 Stunden vor der Infektion.
Anmerkung: Die intraperitoneale Injektion wurde im unteren rechten Quadranten des murinen Abdomens durchgeführt, um eine Schädigung der Bauchorgane wie Harnblase, Blinddarm usw. zu vermeiden. Die Verabreichung einer exogenen Eisenquelle in Form von Eisendextran an Tiere vor der Infektion begünstigt die bakterielle Vermehrung im Wirt.
- Nach 2-3 Stunden führen Sie eine Tieranästhesie mit Ketamin (50 mg/kg) und Xylazin (3 mg/kg) und Augengleitmittel durch.
- Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie sicherstellen, dass beim Einklemmen des Zehs keine Schmerzreaktion auftritt.
- Positionieren Sie die Maus im sternalen Dekubitus und strecken Sie vorsichtig die Gliedmaßen und die Halswirbelsäule, um die Wirbelsäule in einer geraden Position zu halten.
- Mischen Sie die Bakteriensuspension vorsichtig, um eine konsistente Suspension zu erhalten, bevor Sie eine Spritze mit 30 G Nadel x 8 mm laden.
Anmerkung: Bereiten Sie die Bakteriensuspension so nah wie möglich an der Injektionszeit vor. In der Zwischenzeit bei Raumtemperatur lagern.
- Auf der Grundlage des bakteriellen Titers nach dem Auftauen (KBE/ml) fahren Sie mit der Berechnung der insgesamt zu verwendenden KBE in Bezug auf die Gesamtzahl der zu infizierenden Tiere fort (KBE bakterielle Dosis pro Anzahl der Tiere). Fahren Sie mit der Berechnung des genauen Volumens fort, das aus der Durchstechflasche entnommen werden muss, um die Gesamt-KBE zu erhalten, indem Sie ein Verhältnis zwischen dem bakteriellen Titer nach dem Auftauen (KBE/ml) und der Gesamt-KBE anwenden, das für die Infektion von n Mäusen nützlich ist (bakterieller KBE nach dem Auftauen: ml = Gesamt-KBE: x). Legen Sie das endgültige Volumen in Bezug auf die Gesamtzahl der zu infizierenden Tiere fest.
Anmerkung: In diesen Versuchen wurde ein breites Spektrum von Titern von 104 bis 109 pro Tier verwendet.
- Reinigen Sie den Operationsbereich mit 70% Ethanol.
- Bestimmen Sie die Injektionsstelle mit Hilfe einer Nadel und injizieren Sie die etablierte KBE von Meningokokken (Wildtyp-Stamm und isogener Mutantenstamm) oder GC-Bouillon, die als Kontrolle mit Eisendextran (5 mg/kg) zugesetzt ist, in einem Gesamtvolumen von 10 μL durch ein okzipitales Bohrloch mit einer 30 G Nadel x 8 mm in die Cisterna magna von Mäusen.
- Führen Sie das zisternale Inokulum durch, indem Sie die Nadel am kraniozervikalen Übergang platzieren, genauer gesagt im dorsalen Subarachnoidalraum. Ventroflex den Kopf, um diesen Raum zugänglich zu machen.
- Legen Sie das Tier kurz in die Seitenlage, halten Sie die Ohren aus dem Weg und beugen Sie den Hals mäßig (90 bis 100°). Achten Sie darauf, dass sich die Mittellinie des Halses und des Kopfes (von der Nase bis zum Hinterhaupt) in einer perfekt parallelen Position zur Tischplatte befindet.
- Berühren Sie die Atlasflügel und stellen Sie sicher, dass sie sich überlappen, um eine axiale Drehung zu vermeiden. Eine natürliche Vertiefung kann in der Regel an der Mittellinie berührt werden, wo die Nadel am ehesten in das Hinterhauptloch eindringt.
- Entsorgen Sie die Spritze und die Nadel sicher nach der Injektion von Neisseria an Mäuse.
- Setzen Sie das Tier in den Käfig und warten Sie auf das Erwachen und die vollständige Wiederherstellung der Bewegung.
- Bewahren Sie die Käfige mit infizierten Mäusen unter einem Laminar-Flow-Schrank auf.
- Überwachen Sie Mäuse 24 Stunden nach der Infektion auf klinische Anzeichen eines Komas gemäß der Komaskala. Komaskala: 1 = Koma, 2 = steht nach dem Drehen auf den Rücken nicht aufrecht, 3 = steht innerhalb von 30 s aufrecht, 4 = steht innerhalb von 5 s aufrecht, minimale Gehtätigkeiten, 5 = normal.
Anmerkung: Wenn bei Tieren Schmerzen festgestellt wurden, wurde eine Analgesie mit Meloxicam (5 mg/kg i.p. für die Dauer der Studie) verabreicht.
>2. Überleben von Tieren und KBE-Zahlen
- Das Überleben der Tiere
- Bakterielle Inokula in unterschiedlichen Dosen (im Bereich von 10,4 bis 109 KBE pro Maus) zur Infektion von Tieren auf dem i.cist. Weg vorbereiten.
- Kontrollmäuse werden auf die gleiche Weise mit GC-Brühe geimpft, die mit Eisendextran (5 mg/kg) ergänzt wird.
Die - Tiere sind während des gesamten Versuchs täglich für 168 Stunden (7 Tage) mindestens zweimal täglich für die Dauer des Versuchs auf klinische Symptome zu überwachen: zerzaustes Fell, gekrümmtes Aussehen, Unterkühlung, Gewichtsverlust, Lethargie oder Sterben.
- Messen Sie das Körpergewicht und die Temperatur mit einer digitalen Waage bzw. einem rektalen Thermometer jeden Tag.
- Erfassen Sie das Überleben von Mäusen für eine Woche.
Anmerkung: Notieren Sie den natürlichen Tod des Tieres nach der Infektion, während die Tiere, die einen Komawert von 2 erreichen oder die länger als 168 Stunden Beobachtung überleben, eingeschläfert werden.
- Mäuse mit einem Komawert von 2 oder die über den Beobachtungszeitraum überleben, werden mit Ketamin (50 mg/kg) und Xylazin (3 mg/kg) betäubt und mit Augensalbe aufgetragen.
- Vergewissern Sie sich, dass die Schmerzreaktion durch ein Zehenkneifen fehlt.
- Führen Sie eine Euthanasie von Mäusen durch Gebärmutterhalsluxation durch und erfassen Sie sie als tot für die statistische Analyse.
- Fahren Sie mit dem Überlebens- oder KBE-Test an den infizierten Tieren fort.