Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Mausquelle und Gehäuse
- Ableitung von LysM-eGFP-Mäusen auf einem genetischen Hintergrund von C57BL/6J. Ableitung von LysM-EGFP×MyD88-/- Mäusen durch Kreuzung von LysM-EGFP-Mäusen mit MyD88-/- Mäusen auf einem C57BL/6J-Hintergrund.
- Hausmäuse in einem Vivarium. Für diese Studien wurden die Tiere vor der Operation an der University of California, Davis, in Gruppen und nach der Operation in Einzelunterkünften untergebracht. Verwenden Sie Mäuse im Alter von 10-16 Wochen.
>2. Bakterielle Vorbereitung und Quantifizierung
- Nehmen Sie den biolumineszierenden S. aureus-Stamm von Interesse aus der Lagerung bei -80 °C, um ihn auf Eis aufzutauen. Streifen auf einer Agarplatte aus 5 % Rinderblut. Inkubieren Sie die Streifenplatte in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C über Nacht (16 h).
Anmerkung: In diesem Protokoll wurde der ALC2906 SH1000-Stamm verwendet. Dieser Stamm enthält das Shuttle-Plasmid pSK236 mit den Penicillin-bindenden Protein-2-Promotoren, die mit der luxABCDE-Reporterkassette von Photohabdus luminescens fusioniert sind.
- Bereiten Sie tryptische Sojabrühe (TSB) zu, indem Sie 0,03 g TSB-Pulver pro ml reinem Wasser mischen und TSB zum Sterilisieren autoklavieren. Nach dem Abkühlen alle notwendigen Antibiotika mit einer sterilen Technik hinzufügen. In diesem Protokoll fügen Sie 10 μg/ml Chloramphenicol zum TSB hinzu, um das pSK236-Shuttle-Plasmid, das die Biolumineszenz-luxABCDE-Kassette enthält, für die Expression auszuwählen.
- Entnehmen Sie 3-4 separate Kolonien aus der S. aureus-Platte in TSB mit 10 μg/ml Chloramphenicol, um eine Übernachtkultur zu starten. Inkubieren Sie die Bakterien auf einem Inkubationsschüttler bei 37 °C über Nacht (16 h).
- Starten Sie eine neue Bakterienkultur aus der Übernachtkultur, indem Sie eine Probe 1:50 mit 10 μg/ml Chloramphenicol in TSB verdünnen. Kultur in einem Inkubationsschüttler bei 200 U/min und 37 °C.
- Zwei Stunden nach der Spaltung des S. aureus wird die optische Dichte bei 600 nm (OD600) mit einem Spektralphotometer überwacht. Beobachten Sie den OD600 über der Zeit, um das Wachstum in der mittleren logarithmischen Phase zu finden. Für den ALC2906 SH1000-Stamm ist ein OD600 von 0,5 mittellogarithmisch und entspricht einer Konzentration von 1 x 108 KBE/ml (Abbildung 1).
- Bei einem OD600 von 0,5 werden die Bakterien 1:1 mit eiskaltem DPBS gewaschen. Die Bakterien 10 min bei 3.000 x g und 4 °C zentrifugieren. Den Überstand vorsichtig dekantieren und zusätzlich gekühltes DPBS hinzufügen und gründlich vortexen. Nochmals 10 min bei 3.000 x g und 4 °C zentrifugieren.
- Den Überstand vorsichtig dekantieren. Resuspendieren Sie das Bakterienpellet in der gewünschten Konzentration. Für diese Studien werden 3 ml ALC2906 SH1000 entnommen und in 1,5 ml PBS resuspendiert, was einer Bakterienkonzentration von etwa 2 x 108 KBE/ml entspricht. Bewahren Sie die Bakterien bis zur Verwendung auf Eis auf.
- Um die Bakterienkonzentration zu überprüfen, verdünnen Sie 100 μl der Bakterienprobe 1:10.000 und 1:100.000 in PBS. Platte 20 μL Aliquots auf einer Agarplatte. Inkubieren Sie bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator für 16 h. Zählen Sie die KBE durch grobe Untersuchung und berechnen Sie eine Bakterienkonzentration am nächsten Tag.
>3. Exzisionsverletzung der Haut und Inokulation mit S. aureus
- Verabreichen Sie jeder Maus 100 μl 0,03 mg/ml Buprenorphinhydrochlorid (~0,2 mg/kg) durch intraperitoneale Injektion.
- Zwanzig Minuten nach der Injektion legen Sie 2-4 Mäuse in eine Kammer mit 2-3 LPM Sauerstoff mit 2-4% Isofluran. Sobald die Mäuse vollständig betäubt sind, übertragen Sie die Mäuse nacheinander in einen Nasenkegel, der mit 2-3 LPM Sauerstoff und 2-4% Isofluran verbunden ist. Stellen Sie sicher, dass die Mäuse vollständig betäubt sind, indem Sie jede hintere Pfote fest zwischen Daumen und Zeigefinger klemmen. Fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort, wenn das Tier nicht auf das Kneifen reagiert.
- Rasieren Sie einen 1 x 2 Zoll großen Abschnitt auf der Rückseite der Maus mit einer elektrischen Haarschneidemaschine und befreien Sie den Bereich mit einem sauberen Tuch oder einer Gaze von Fellabfällen. Vermeiden Sie die Verwendung von Enthaarungslotion, da diese übermäßige Entzündungen verursachen kann.
- Reinigen Sie die Rückseite der Maus zuerst mit 10 % Povidon-Jod-getränkter Gaze und dann mit 70 % Ethanol-getränkter Gaze. Reinigen Sie den Bereich spiralförmig und bewegen Sie sich von der Mitte des Operationsbereichs nach außen. Warten Sie vor der Operation ca. 1 Minute, bis der Operationsbereich getrocknet ist.
- Halten Sie den rasierten Rücken der Maus locker zwischen zwei Fingern und drücken Sie eine sterile 6 mm Stanzbiopsie fest in die Mitte des vorbereiteten Operationsbereichs. Ziehen Sie die Haut nicht straff.
- Drehen Sie die Stanzbiopsie, um einen kreisförmigen Umriss auf der Haut zu erzeugen, der die Haut in mindestens einem Abschnitt des Umrisses vollständig durchschneidet. Achten Sie darauf, nicht in die darunter liegende Faszie oder das Gewebe zu schneiden.
- Verwenden Sie eine sterile Schere und Pinzette, um die Epidermis und Dermis nach dem kreisförmigen Muster zu durchtrennen, das von der Stanzbiopsie geprägt wurde.
>4. S. aureus Inokulation
- Füllen Sie eine 28-G-Insulinspritze mit dem gewünschten biolumineszierenden bakteriellen Impfmittel. In dieser Studie wird eine Konzentration von 1 x 108 KBE/ml (50 μl) verabreicht. Verabreichen Sie nicht mehr als 100 μl Volumen.
- Injizieren Sie 50 μl Impfmittel zwischen Faszie und Gewebe in der Mitte der Wunde auf dem Rücken der Maus. Stellen Sie sicher, dass das Impfmittel in der Mitte der Wunde eine Blase mit minimaler Leckage oder Dispersion bildet.
- Ziehen Sie die Dermis zur Seite, halten Sie die Spritze fast parallel zum Gewebe und schieben Sie die Spritze langsam in das Gewebe, bis ein plötzlicher Rückgang des Widerstands zu spüren ist, was auf ein Durchstechen der Faszie hinweist. Führen Sie die Spritze vorsichtig in die Mitte der Wunde und geben Sie das Impfmittel langsam ab. Nehmen Sie die Spritze langsam vom Tier ab.
- Injizieren Sie die gleiche Menge steriles PBS in die Wunden nicht infizierter Tiere wie oben beschrieben.
- Bringen Sie das Tier in seinen Käfig zurück. Stellen Sie den Käfig unter eine Wärmelampe oder auf ein Heizkissen und überwachen Sie das Tier, bis es sich von der Narkose erholt hat.
>5. In vivo BLI und FLI
- Initialisieren Sie den Imager für das gesamte Tier über die Gerätesoftware. Betäuben Sie Mäuse in einer Kammer, die 2-3 LPM Sauerstoff mit 2-4% Isofluran erhält. Führen Sie eine Anästhesie an die Nasenkegel im Inneren des Imagers durch.
- Setzen Sie die verwundete und infizierte Maus in den Imager ein. Positionieren Sie die Maus so, dass die Wunde so flach wie möglich ist. Verwenden Sie die folgende Sequenzeinstellung, um die Mäuse abzubilden.
- Wählen Sie Lumineszenz und Fotografieren als Bildgebungsmodus aus. Die Belichtungszeit beträgt 1 min bei Small Binning und Blende 1 (Lumineszenz) und Blende 8 (Fotografie). Der Emissionsfilter ist offen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Erfassen, um das Bild aufzunehmen.
- Wählen Sie Fluoreszenz und Fotografieren als Bildgebungsmodus. Die Belichtungszeit beträgt 1 s bei Small Binning und Blende 1 (Fluoreszenz) und Blende 8 (Foto) bei einer Anregungswellenlänge von 465/30 nm und einer Emissionswellenlänge von 520/20 nm bei hoher Lampenintensität. Klicken Sie auf die Schaltfläche Erfassen, um das Bild aufzunehmen.
- Bringen Sie das Tier in seinen Käfig zurück und überwachen Sie es, bis es sich von der Narkose erholt hat.
- Stellen Sie sich Mäuse täglich wie oben beschrieben vor.
>6. Bildanalyse
- Offene Bilder, die quantifiziert werden sollen.
- Platzieren Sie für jede Maus im Bild einen großen kreisförmigen Bereich von Interesse (ROI) über den gesamten Wundbereich, einschließlich der umgebenden Haut. Die neutrophilen in vivo FLI EGFP-Signale und in vivo BLI S. aureus-Signale reichen nach mehreren Tagen über den Wundrand hinaus und wurden in diese Studien einbezogen (Abbildungen 2A und 2B). Klicken Sie auf ROI messen und Werte für den mittleren Fluss für jede Maus aufzeichnen. Plotten Sie den mittleren Fluss jedes Signals (p/s) über die Zeit.
- Wenn absolute Zahlen von Neutrophilen oder S. aureus in der Wunde gewünscht sind, führen Sie die folgenden Versuche durch.
- Um die Anzahl der Neutrophilen mit den in vivo FLI-EGFP-Signalen zu korrelieren, wurden C57BL/6J-Mäuse wie oben beschrieben verwundet und eine Reihe von Neutrophilen aus dem Knochenmark (5 x 105 bis 1 x 107) von LysM-EGFP- oder LysM-EGFPxMyD88-/--Spendern direkt auf verschiedene Wunden übertragen. Bild wie oben beschrieben und korrelieren Sie die in vivo FLI EGFP-Signale mit der bekannten Menge an Neutrophilen.
- Um S. aureus CFU mit den in vivo BLI-Signalen zu korrelieren, werden Mäuse wie oben beschrieben verwundet und infiziert. Am Tag 1 nach der Infektion werden in vivo BLI-Signale von den Mäusen aufgezeichnet und die Kadaver sofort eingeschläfert und gekühlt. Exzitieren Sie die Wunde, homogenisieren Sie das Gewebe und plattieren Sie die bakteriellen Verdünnungen auf Agar für die Inkubation über Nacht. Zählen Sie am nächsten Tag die Kolonien, um die KBE pro Wunde zu bestimmen.
- Um die Wundheilung zu messen, passen Sie einen kreisförmigen ROI über den Wundrand an, messen Sie die Fläche der Wunde (cm 2) und zeichnen Sie die prozentuale Veränderung von der Grundlinie über die Zeit auf (Abbildung 2C).
