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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Induktion einer Entzündung der Augenoberfläche an der Maus
- Führen Sie eine Immunogenvorbereitung für die Immunisierung durch.
- Bereiten Sie das Immunogen am Tag der Immunisierung frisch vor, indem Sie Ovalbumin (OVA, 50 mg/ml) und Pertussistoxin (100 μg/ml) in Kochsalzlösung und das Adjuvans Aluminiumhydroxid (40 mg/ml) (siehe Materialtabelle) im Verhältnis 1:1 mischen
Vorsicht: Führen Sie das Öffnen, die Rekonstitution und die Immunogenvorbereitung von Pertussis-Toxin in einer laminaren Sicherheitswerkbank durch. Tragen Sie Schutzkleidung und vermeiden Sie jeglichen Kontakt mit der Haut.
- Inkubieren Sie das Immunogen-Adjuvans-Gemisch 30 Minuten lang bei Raumtemperatur und geben Sie 100 μl in eine 1-ml-Spritze.
- Führen Sie eine intraperitoneale Injektion der Immunogenlösung in eine nicht anästhesierte Maus durch.
- Halten Sie die Maus sanft am Schwanz, während Sie das Käfiggitter greifen. Halten Sie die Haut des Rückens und des Halses zwischen Daumen und Zeigefinger fest und fixieren Sie den Schwanz und die unteren Gliedmaßen zwischen Ring- und kleinem Finger an der Handfläche.
- Halten Sie die feste Maus mit dem Kopf nach unten.
- Injizieren Sie 100 μl der vorbereiteten Immunogenlösung in den rechten oder linken Quadranten der unteren Bauchhöhle
.
- Führen Sie 2 Wochen nach der Immunisierung eine Augenoberflächen-Challenge durch.
- Betäuben Sie die Maus mit Isofluran (2,5%).
- Tragen Sie 5 μl OVA (50 mg/ml) oder Kochsalzlösung (0,9 % NaCl) pro Auge auf beide Augen auf und warten Sie, bis der Tropfen vom Auge aufgenommen wird. Dies dauert ~5 Minuten.
- Wiederholen Sie den Vorgang 1x täglich für 7 Tage.
Anmerkung: Die topische Verabreichung von Medikamenten kann auf die gleiche Weise erfolgen.
>2. Sammlung von okulären Exsudaten
- Gewinnen Sie die während der Provokationsphase gebildeten Augenexsudate zurück, indem Sie unmittelbar nach der Provokation 50 μl sterile Kochsalzlösung auf das Auge auftragen.
>3. Exzision von Geweben der Augenoberfläche
- Präparieren Sie die Augenlider und den Augengloben mit den folgenden Schritten.
- Euthanasieren Sie die Maus durch CO2 -Erstickung und Gebärmutterhalsluxation.
- Platzieren Sie die Maus auf einer ebenen Fläche.
- Desinfizieren Sie die Augenhöhle mit einem mit 70% Ethanol imprägnierten Tupfer.
- Machen Sie einen Schnitt zwischen dem Ohr und der Sinus retroorbitalis und entlang der Oberfläche über dem Plattenepithelknochen vertikal, wobei Sie den Schnitt horizontal unterhalb des unteren Augenlids entlang des Oberkieferknochens und oberhalb des oberen Augenlids entlang des Stirnbeins verlängern. Dabei bildet sich ein Schnitt um das Auge (Abbildung 1).
- Halten Sie das präparierte Gewebe vorsichtig mit einer gebogenen Pinzette um das Auge herum und ziehen Sie das Gewebe und den Augapfel heraus.
- Legen Sie die herausgeschnittenen Organe in steriles PBS.
- Schneiden Sie überschüssiges Gesichtsmuskelgewebe um die exzidierten oberen Augenlider mit einem Skalpell und unter dem Stereomikroskop ab.
- Entnehmen Sie die Bindehaut, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
- Legen Sie das obere Augenlid auf eine trockene Petrischale unter dem Stereomikroskop.
- Mit einer feinen Pinzette und einem Skalpell die weißlich-schleimige Schicht ganz vorsichtig aus der Innenfläche des Augenlids schälen.
- Präparieren Sie als Nächstes die Hornhaut, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
- Legen Sie den Augengloben für 3 Minuten auf eine neue trockene Petrischale auf Trockeneis.
- Bringen Sie die Petrischale in einer stabilen Position auf die Arbeitsfläche.
- Machen Sie mit einer feinen, scharfen Schere einen kleinen Schnitt am Rand der Hornhaut neben dem Limbus.
- Verlängern Sie den Schnitt mit dem Skalpell um den Augenballen und trennen Sie die Sklera von der Hornhaut.
- Entfernen Sie Reste der Iris und der Linse von der Rückseite der Hornhaut, indem Sie sie großzügig mit Kochsalzlösung spülen.
