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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Ableitung und Aktivierung von Knochenmarkmakrophagen mit Antikörpern
- Führen Sie Sterbehilfe durch CO2 -Erstickung durch.
- Legen Sie die Maus in die Induktionskammer. Euthanasthan die Maus mit 5% Isofluran-Anästhesie für 60 - 90 s einschläfern, bis sie unbeweglich ist und tief und langsam atmet.
- Schalten Sie die Isofluran-Anästhesie aus und verabreichen Sie 6 - 8 l/min CO2, bis die Maus aufgehört hat zu atmen. Lassen Sie die Maus mindestens weitere 5 Minuten lang mit CO2 eingeschaltet. Stellen Sie sicher, dass kein Herzschlag oder keine Atmung mehr zu hören ist. Führen Sie eine Gebärmutterhalsluxation durch, um den Tod sicherzustellen.
HINWEIS: 8 - 12 Wochen alte Mäuse liefern die höchste Ausbeute an Makrophagen.
- Mäusebeine mit 70% Ethanol einsprühen und mit ausgestreckten Armen und Beinen in Rückenlage über eine Schaumstoffplatte stecken. Machen Sie mit einer Schere und einer Pinzette, um die Haut zu halten, einen flachen Schnitt (0,2 cm), um die Haut und das Fell von der Oberfläche jedes der Hinterbeine zu entfernen.
Anmerkung: Führen Sie dieses Verfahren und alle Gewebekulturmanipulationen in einer sterilen Haube durch.
- Trimmen Sie die Muskeln, um Schienbeine und Oberschenkelknochen sichtbar zu machen. Entfernen Sie die Tibias und Femurs, indem Sie den Knochen und die Muskeln direkt unterhalb des Hüftgelenks und oberhalb der Knöchel durchtrennen. Schneiden Sie so viele Muskeln wie möglich ab.
- Besprühen Sie die Knochen mit 70 % Ethanol und warten Sie 1 Minute, bis es verdunstet ist, und legen Sie sie dann in eine 6-Well-Platte mit Knochenspülmedium (Iscove's modifiziertes Dulbecco-Medium (IMDM), 10 % fötales Rinderserum (FBS)).
- Schneiden Sie die Enden der Knochen ab, indem Sie 0,1 cm Knochen vom Knöchel und der Oberseite des Oberschenkelknochens abschneiden, so dass die Knochenhöhle freiliegt. Stellen Sie sicher, dass das Knochenmark sichtbar ist und eine 26-Gauge-Nadel in die Knochenhöhle eingeführt werden kann.
- Schneide die Knochen und Muskeln durch, um die Tibias und Femurs von den Kniegelenken zu trennen. Führen Sie eine 26-Gauge-Nadel, die an einer 10-ml-Spritze befestigt ist, in den Hohlraum ein. Spülen Sie das Knochenmark in ein konisches 50-ml-Röhrchen mit 5 mL Knochenspülmedium. Spülen Sie zwei Tibias und zwei Femure aus einer Maus in jedes 50-ml-Röhrchen.
- Pipettieren Sie mehrmals auf und ab oder wirbeln Sie das Knochenmark mit langsamer Geschwindigkeit, um die Klumpen sanft zu verteilen. Die Knochenmarkfäden sollten in kleine (weniger als 0,5 mm) Markflecken zerlegt werden. Füllen Sie das konische Röhrchen auf 50 mL mit dem Bone Flush Medium. Der Inhalt des konischen Röhrchens wird in einen 75 cm2 mit Gewebekulturen behandelten Kolben pipettiert und bei 37 °C 5 % CO2 für 1 h.
inkubiert.
Anmerkung: Reife Makrophagen und mesenchymale Zellen haften an dem Kolben und werden verworfen, während die gewünschten hämatopoetischen Vorläuferzellen in Suspension bleiben.
- Pipettieren Sie das Medium mit hämatopoetischen Vorläuferzellen in ein konisches 50-ml-Röhrchen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 300 x g bei Raumtemperatur für 5 min. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 5 ml Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor (MCSF)-Kulturmedium (IMDM, 10 % FBS, 5 ng/ml MCSF, 100 U/ml Penicillin/Streptomycin und 150 μM Monothioglycerin (MTG)).
- Zählen Sie Zellen mit einem Hämozytometer. Medium zur Resuspendierung der Zellen in einer Konzentration von 0,5 x 106 Zellen/ml, 1,5 x 107 Zellen/Kolben in 30 ml Medium zugeben und vorsichtig auf und ab pipettieren. 30 ml Suspension in einen neuen, mit Gewebekulturen behandelten 75 cm2-Kolben pipettieren.
- Überprüfen Sie an Tag 4 und Tag 7 nach der Erstkultur in Schritt 1.9, ob die Zellen adhärent und leicht verzweigt sind, indem Sie ein invertiertes Phasenkontrast-Hellfeldmikroskop verwenden. Entsorgen Sie das Medium, das die nicht adhärenten Zellen enthält. Waschen Sie die Zellen einmal mit IMDM und fügen Sie 30 ml MCSF-Kulturmedium hinzu.
- Wenn die Zellen am 10. Tag reif sind (>95% positiv für F4/80 und Mac-1), überprüfen Sie erneut, ob die Zellen leicht adhärent sind.
- Um Zellen für die Stimulation zu plattieren, nehmen Sie das Kulturmedium aus dem Kolben und fügen Sie 8 ml enzymfreien, EDTA-basierten Zelldissoziationspuffer hinzu (Materialtabelle). Inkubieren Sie die Zellen 5 Minuten lang bei 37 °C, 5 % CO2.
- Kratzen Sie die Zellen vorsichtig mit etwas Druck mit einem sterilen Zellschaber ab. Prüfen Sie am Mikroskop, ob sich die Zellen von der Kolbenoberfläche gelöst haben. Pipettieren Sie dissoziierte Zellen in ein konisches 50-ml-Röhrchen. Spülen Sie den Kolben 3 Mal mit 5 mL IMDM und poolen Sie die Spüllösung mit den geernteten Zellen. Zellen bei 300 x g bei Raumtemperatur 5 min zentrifugieren.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet in 3 mL MCSF-Kulturmedium pro konischem 50-mL-Röhrchen. Zählen Sie lebensfähige Zellen mit einem Hämozytometer. Resuspendieren Sie die Zellen in einer Konzentration von 1 x 106 Zellen/ml und einer Platte von 100 μl Zellsuspension (1 x 105 Zellen/Well) pro Well einer mit 96 Wells behandelten Gewebekultur mit flachem Boden<>
Anmerkung: Knochen aus einer Maus erzeugen genug Zellen für 100 Vertiefungen. Falls gewünscht, kann 1 ml Zellen in einer 6-Well-Platte plattiert werden (Gewebekultur behandelt, flacher Boden). Eine größere Anzahl von Zellen (1 x 10,6 Zellen) kann für Western-Blot-Analysen nützlich sein.
- Nach der Adhärierung stimulieren Sie doppelte oder dreifache Vertiefungen mit jeweils 10 ng/ml LPS in IMDM, 30 mg/ml IVIg oder IVIg + LPS. Die Dosen von LPS oder IVIg können titriert werden, um das Ansprechen zu optimieren. Lassen Sie doppelte oder dreifache Vertiefungen als nicht stimulierte Kontrollen. Inkubieren Sie sie 24 h lang (37 °C, 5 % CO2).
Anmerkung: Erneut plattierte Zellen sollten innerhalb von 1 h an den Gewebekultur-Wells haften.
- Sammeln Sie die Zellüberstände aus jeder Vertiefung in einzelne 1,7-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und entfernen Sie alle Partikel, indem Sie sie 5 Minuten lang bei 10.000 x g drehen.
- Entfernen Sie den Zellüberstand und vermeiden Sie es, das Pellet zu stören. Der geklärte Zellüberstand wird in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen gegeben
Anmerkung: Zellüberstände können mittels Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) sofort auf Zytokine IL-10 und die Zytokin-Untereinheit IL-12/23p40 getestet oder langfristig bei -80 °C gelagert werden. Befolgen Sie das ELISA-Protokoll aus einem im Handel erhältlichen Kit (Table of Materials). Andere proinflammatorische Zytokine wie IL-6 und TNF können getestet werden, da sie durch die gleichzeitige Behandlung mit IVIg + LPS-Stimulation im Vergleich zur Stimulation mit LPS allein ebenfalls reduziert werden. Nach der Stimulation können adhärente Zellen für Techniken wie Western Blotting oder quantitative Polymerase-Kettenreaktion (Q-PCR) vorbereitet werden.