Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Herausforderung von Mäusen in vivo mit intravenösem Immunglobulin und Lipopolysaccharid (IVIg+LPS) und Gewinnung von Peritonealmakrophagen
- Wiegen Sie jede Maus. Berechnen Sie das Volumen von IVIg (100 mg/ml Stammkonzentration), das erforderlich ist, um eine endgültige Dosis von 2,5 g/kg Körpergewicht bereitzustellen. Berechnen Sie die Menge an LPS (100 μg/ml Stammkonzentration in Iscoves modifiziertem Dulbecco-Medium (IMDM)), die erforderlich ist, um eine endgültige Dosis von 0,2 μg/g Körpergewicht zu erreichen.
Anmerkung: Für eine 20-g-Maus sind beispielsweise 500 μl IVIg-Stammlösung und 40 μl einer 100 μg/ml-LPS-Lösung erforderlich.
- Ziehen Sie die erforderliche Menge IVIg und LPS in eine sterile 1-ml-Spritze, die mit einer sterilen 26-Gauge-Nadel ausgestattet ist. Bei Kontrollmäusen, die keine IVIg erhalten, ersetzen Sie ein äquivalentes Volumen IVIg durch sterile phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) pH 7,4.
- Greifen Sie die Maus mit einer Hand in den Nacken, indem Sie mit Daumen und Zeigefinger die Haut im Nacken greifen und mit den restlichen Fingern den Schwanz und die Hinterbeine festhalten. Neige seinen Körper in Richtung Boden.
- Platzieren Sie die Nadel in einem Winkel von 30 - 40° relativ zum Bauch der Maus im unteren rechten Quadranten, schrägen Sie sie ab und führen Sie 1,5 cm ein. Injizieren Sie das IVIg + LPS oder PBS + LPS intraperitoneal.
- Führen Sie nach 1 Stunde eine Euthanasie durch Erstickung durch Kohlendioxid (CO2) durch.
- Stellen Sie die Maus in eine Induktionskammer. Euthanasthan die Maus mit 5% Isofluran-Anästhesie für 60 - 90 s einschläfern, bis sie unbeweglich ist und tief und langsam atmet.
- Schalten Sie die Isofluran-Anästhesie aus und verabreichen Sie 6-8 l/min CO2, bis die Maus aufgehört hat zu atmen. Lassen Sie die Maus mindestens weitere 5 Minuten lang mit CO2 eingeschaltet. Stellen Sie sicher, dass kein Herzschlag oder keine Atmung mehr zu hören ist. Führen Sie eine Gebärmutterhalsluxation durch, um den Tod sicherzustellen.
HINWEIS: 8 - 12 Wochen alte Mäuse liefern die höchste Ausbeute an Makrophagen.
- Heften Sie die Maus mit ausgebreiteten Gliedmaßen an eine Schaumstoffplatte. Besprühen Sie die Teile mit 70%igem Ethanol.
Anmerkung: Führen Sie den Eingriff in einer sterilen Haube durch.
- Machen Sie mit einer Schere einen flachen Schnitt in der Haut (0,2 cm) entlang der Mittellinie der Maus, um ein Einschneiden der Bauchhöhle zu vermeiden. Ziehen Sie die Bauchhaut der Maus mit einer Pinzette vom Bauch ab, so dass die Auskleidung der intakten Bauchwand sichtbar ist.
- Füllen Sie eine 5-ml-Spritze mit 5 mL sterilem PBS (pH 7,4). Führen Sie eine 25- oder 27-Gauge-Nadel am oberen Rand des Hohlraums von der linken oder rechten Seite zur Mitte der Maus ein, wobei die Abschrägung der Nadel nach oben zeigt.
Anmerkung: Platzieren Sie die Nadel vorsichtig in der Maus, so dass Sie PBS nicht in die Organe, sondern in den Bauchraum injizieren.
- Schieben Sie die Flüssigkeit in die Bauchhöhle. Ziehen Sie die Nadel aus der Kavität und massieren Sie das Bauchfell 10 s lang, um alle Zellen zu entfernen. Führen Sie die Nadel am oberen Ende des Hohlraums ein und vermeiden Sie Organe. Sammeln Sie die zurückgewonnene Spülflüssigkeit und geben Sie sie in ein konisches 15-ml-Röhrchen auf Eis.
Anmerkung: Pro 5 ml injizierter Flüssigkeit werden etwa 3,75 ml zurückgewonnen.
- Wiederholen Sie die Injektion und Wiederherstellung (Schritte 1.8 - 1.9) noch 3 weitere Male (Gesamtinjektionsvolumen von 20 mL), um insgesamt 15 ml Spülflüssigkeit zurückzugewinnen. Sammeln Sie die Spülung von jeder Maus in ein separates konisches 15-ml-Röhrchen.
Anmerkung: Nach der letzten Injektion kann es einfacher sein, die Flüssigkeit aus der linken und rechten Seite der Maus zu extrahieren, wo sich Flüssigkeit angesammelt hat. Die Organe werden die Nadel an dieser Position weniger stören.
- Schleudern Sie die Zellen bei 300 x g für 5 min bei 4 °C. 1 ml der zurückgewonnenen Lavageflüssigkeit entnehmen und für Interleukin- oder IL-10- und IL-12/23p40-Analysen mittels Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) gemäß den Anweisungen des Herstellers verwenden oder für zukünftige Analysen bei -80 °C einfrieren.
Anmerkung: Um einen genauen Vergleich zwischen den Behandlungen für die Zytokinanalyse der Spülflüssigkeit zu gewährleisten, führen Sie 4 Mal-Spülungen der Peritonealhöhle mit 5 ml für ein Endvolumen von 15 ml durch. Nicht die gesamte Flüssigkeit wird aus jeder Spülung zurückgewonnen.
- Resuspendieren Sie die Zellen in 500 μl Plattierungsmedium (IMDM, 10 % fötales Rinderserum, FBS und 100 U/ml Penicillin/Streptomycin) pro gespülter Maus. Zählung lebensfähiger Makrophagen.
Anmerkung: Die Makrophagen sind etwas größer als die anderen Peritonealzellen. Die typische Ausbeute beträgt 5 x 105 - 1 x 106 Makrophagen/Maus bei Verwendung einer Wildtyp-Maus vom Typ C57BL/6.
wahlfrei: Wenn eine große Anzahl roter Blutkörperchen im Zellpellet vorhanden ist, führen Sie einen Lyseschritt gemäß den Anweisungen des Herstellers durch, um diese zu entfernen.
- Resuspendieren Sie die Zellen im Plattierungsmedium mit 1 x 106 Makrophagen/ml und einer Platte von 100 μl pro Vertiefung in einer 96-Well-Platte mit Flachboden, die mit einer Gewebekultur behandelt wurde.
Anmerkung: Es kann notwendig sein, Zellen von mehr als einer Maus für ein Experiment zu poolen. Wenn eine Maus beispielsweise 5 x 105 Makrophagen hätte, wären 500 μl Beschichtungsmedium erforderlich.
- Die Zellen werden 1 h lang bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert, damit die Makrophagen adhärent werden können. Die adhärenten Zellen sind die Peritonealmakrophagen. Entfernen Sie Zellüberstände und nicht adhärente Zellen. Spülen Sie die Vertiefungen zweimal mit 200 μl IMDM (vorgewärmt auf 37 °C), warten Sie 10 s und kippen Sie die Platte langsam. Ersetzen Sie das Beschichtungsmedium. Inkubieren Sie die Zellen vor der Stimulation 30 Minuten lang bei 37 °C, 5 % CO2.
- Nach der Adhärenz stimulieren Sie doppelte oder dreifache Vertiefungen mit jeweils 10 ng/ml LPS in IMDM, 30 mg/ml IVIg oder IVIg+LPS. Die Dosen von LPS oder IVIg können titriert werden, um das Ansprechen zu optimieren. Lassen Sie doppelte oder dreifache Vertiefungen als nicht stimulierte Kontrollen. Inkubieren Sie sie 24 h lang (37 °C, 5 % CO2).
Anmerkung: Erneut plattierte Zellen sollten innerhalb von 1 h an den Gewebekultur-Wells haften. Die Proben können sofort verwendet oder eingefroren und bei -80 °C für die Zytokinanalyse mittels ELISA gelagert werden.
- Sammeln Sie die Zellüberstände aus jeder Vertiefung in einzelne 1,7-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und entfernen Sie alle Partikel, indem Sie sie 5 Minuten lang bei 10.000 x g drehen.
- Entfernen Sie den Zellüberstand und vermeiden Sie es, das Pellet zu stören. Der geklärte Zellüberstand wird in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen gegeben
Anmerkung: Zellüberstände können sofort mittels ELISA auf Zytokine IL-10 und die Zytokin-Untereinheit IL-12/23p40 untersucht oder langfristig bei -80 °C gelagert werden. Befolgen Sie das ELISA-Protokoll aus dem im Handel erhältlichen Kit (Tabelle der Materialien). Andere proinflammatorische Zytokine wie IL-6 und Tumornekrosefaktor (TNF) können getestet werden, da sie durch die gleichzeitige Behandlung mit IVIg+LPS-Stimulation im Vergleich zur alleinigen Stimulation mit LPS ebenfalls reduziert werden. Nach der Stimulation können adhärente Zellen für Techniken wie Western Blotting oder quantitative Polymerase-Kettenreaktion (Q-PCR) vorbereitet werden.
