Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Immunisierung von Mäusen
- Bereiten Sie eine Master-Impfstoffmischung in einem sterilen physiologischen Puffer wie Kochsalzlösung oder DPS vor.
Anmerkung: Das Gesamtvolumen in der Mischung sollte 10 % mehr enthalten als für die Immunisierung der gesamten Gruppe erforderlich. Die Konzentrationen der Impfstoffzusammensetzung sind in den Schritten 1.1.1 und 1.1.2 aufgeführt. Transportieren Sie die Gegenstände auf Eis zum Vivarium.
- Für B. pertussis-Studien sind die folgenden Impfstoffgruppen einzubeziehen: azellulärer Pertussis-Impfstoff (aPV) und aPV + Bordetella-Kolonisationsfaktor A (BcfA). Verwenden Sie außerdem Alaun, Impfstoffantigene allein (filamentöses Hämagglutinin (FHA) und Pertactin (Prn)) und naive (nicht immunisierte) Mäuse als Kontrollgruppen.
HINWEIS: aPV ist 1/5 der menschlichen Dosis eines von der FDA zugelassenen aPV, das aus Tetanustoxoid, reduziertem Diphtherie-Toxoid, Pertussis-Toxoid (PT), filamentösem Hämagglutinin (FHA) und Pertactin (Prn) besteht, das an Aluminiumsalze adsorbiert ist. Eine menschliche Dosis der aktuellen Pertussis aPV beträgt 0,5 ml, daher beträgt 1/5 einer Dosis 0,1 ml. Die Volumina für aPV + BcfA betragen 0,1 mL des aPV (1/5 der menschlichen Dosis) + 0,046 mL BcfA (30 μg) pro Maus. Das maximale Volumen, das sicher an einen Muskel abgegeben werden kann, beträgt 0,1 ml. Da das Volumen des aPV + BcfA-Impfstoffs mehr als 0,1 ml beträgt, muss der Impfstoff in beide Schultern verabreicht werden, die ungefähr zu gleichen Teilen aufgeteilt sind, um sicher verabreicht zu werden.
- Um einen experimentellen Impfstoff herzustellen, kombinieren Sie für eine Dosis 1 μg FHA und 0,5 μg Prn mit 50 μg Aluminiumhydroxidgel in sterilem PBS. Lassen Sie das experimentelle aPV 15 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) auf einer Laborwalze mischen. Danach wird das Röhrchen 5 Minuten lang bei 4 °C bei 18.000 x g gedreht. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie den Inhalt in 1 mL sterilem PBS.
- Stellen Sie im Vivarium das Anästhesiegerät auf (Abbildung 1).
Anmerkung: Stellen Sie vor der Verwendung sicher, dass in den jeweiligen Tanks ausreichend Sauerstoff und Isofluran vorhanden sind. Wiegen Sie den Isofluran-Scavenger-Kanister und ersetzen Sie ihn, wenn sein Gewicht um 50 g zunimmt.
- Reinigen Sie die biologische Sicherheitswerkbank (BSC) gründlich und stellen Sie die saubere Induktionskammer in die BSC. Verbinden Sie die Anästhesie- und Scavenger-Leitungen vom Anästhesiegerät mit der Induktionskammer. Öffnen Sie den Sauerstofftank über den Regler, um sicherzustellen, dass Sauerstoff fließt, und stellen Sie den Füllstand auf 1,5-2 l/min ein.
- Setzen Sie Mäuse im gewünschten Alter (6-12 Wochen) in die Induktionskammer. Schalten Sie das Isofluran auf 2,5-3% ein, um die Mäuse leicht zu betäuben. Überwachen Sie die Tiere, bis sie sich in der Kammer nicht mehr bewegen und sich ihre Atmung verlangsamt hat.
- Testen Sie den Grad der Induktion, indem Sie die Zehen zusammenkneifen und auf reflexartige Bewegungen achten. Wenn es keine gibt, sind die Mäuse bereit zur Injektion.
HINWEIS: In diesem Experiment wurde der gesamte Käfig der Tiere auf einmal betäubt. Man kann wählen, ob man die Tiere einzeln für die Injektion betäubt oder die Tiere ohne Anästhesie injiziert. Jede dieser Methoden ist geeignet.
- Bereiten Sie in der Zwischenzeit 1 ml Insulinspritzen (28G1/2) mit je 0,1 ml Impfstoff vor. Wenn die Tiere vollständig induziert sind, nehmen Sie ein Tier aus der Kammer und legen Sie die Maus ventral auf ein Handtuch oder eine Bankunterlage.
- Verabreichen Sie den Impfstoff intramuskulär. Führen Sie die Spritze in einem Winkel von 45° und mit der Schräge nach oben in einem Winkel von ~5 mm in den Deltamuskel der Maus ein und injizieren Sie den Impfstoff.
Anmerkung: Das hintere Viertel/die hintere Flanke kann anstelle des Deltamuskels als Injektionsstelle verwendet werden.
- Lassen Sie die Nadel nach der Injektion für ~5-10 s in den Muskel eingeführt. Sobald das Volumen abgegeben ist, drehen Sie die Spritze um 180°, so dass die Abschrägung nach weg zeigt, um eine Abdichtung zu schaffen und ein Auslaufen des Impfstoffs zu verhindern. Ziehen Sie dann die Nadel langsam aus der Injektionsstelle.
- Setzen Sie die Maus wieder in den Käfig ein. Wiederholen Sie den Vorgang mit allen Tieren in der angegebenen Gruppe.
- Schalten Sie das Isofluran aus und spülen Sie die Induktionskammer mit Sauerstoff, bevor Sie den nächsten Käfig mit Mäusen betäuben.
- Überwachen Sie die Tiere, bis sie alle wachsam sind und sich im Käfig bewegen. Bringen Sie den Käfig wieder an den Standort des Gehäuses.
- Überwachen Sie die Tiere alle 12 Stunden nach der Impfung, bis zu 48 Stunden, auf klinische Symptome der Morbidität wie raues/ungepflegtes Fell, langsamen Gangs oder Atembeschwerden. Wenn die Symptome anhalten, wenden Sie sich an den Tierarzt der Einrichtung und entfernen Sie die Mäuse bei Bedarf aus der Studie.
- Vier Wochen nach der Erstimmunisierung wird die Maus durch Anästhesie und intramuskuläre Injektionen in den rechten Deltamuskel der Maus mit der gleichen Impfstoffformulierung geboostet, die zuvor verabreicht wurde.
- Überwachen Sie das Tier erneut auf klinische Symptome. Haustiere für weitere 2 Wochen und fahren Sie dann mit der Infektion fort.
>2. Modell der intranasalen Infektion von Mäusen
- Stellen Sie im Vivarium die Sauerstoff- und Anästhesiebedingungen ein, wie in den Schritten 1.3 und 1.4 beschrieben. Wie in Schritt 1.5 beschrieben, legen Sie die Mäuse zur Betäubung in die Kammer. Überwachen Sie die Tiere, bis die Narkose wirkt.
- Wenn die Mäuse betäubt sind, nehmen Sie jeweils ein Tier aus der Induktionskammer. Nehmen Sie die Maus am Schopf des dorsalen Thorax, hinter den Schulterblättern und im Nacken. Positionieren Sie die Maus aufrecht, um auf die Nase zuzugreifen.
- Tragen Sie mit einer 200-μl-Pipettenspitze langsam 40-50 μl des bakteriellen Inokulums von B. pertussis auf die Nasenlöcher der Maus auf (20-25 μl in jeder Nare). Halten Sie die Maus, bis das gesamte Inokulum vom Tier eingeatmet wurde. Wenn ein Teil des Inokulums heraussprudelt, sammeln Sie die Blasen und träufeln Sie sie wieder in die Nasenlöcher. Geben Sie einer Gruppe von Mäusen die gleiche Menge steriles PBS wie eine Negativkontrolle.
- Wie in den Schritten 1.10-1.12 beschrieben, bringen Sie die geimpften Tiere in ihren Käfig zurück und überwachen Sie die Tiere, bis sie wach sind und sich bewegen. Bringen Sie den Käfig wieder an seinen ursprünglichen Platz auf dem Gestell zurück. Spülen Sie die Induktionskammer mit Sauerstoff, um das restliche Isofluran zu entfernen, bevor Sie die nächste Gruppe von Tieren betäuben. Überwachen Sie die Tiere 48 Stunden nach der Infektion.
- Im Labor werden serielle Verdünnungen des Inokulums in sterilem PBS plattiert, um die tatsächlich an die Mäuse abgegebenen koloniebildenden Einheiten (KBE) zu überprüfen. Platte 0,1 ml Verdünnungen auf 10 % BG + Sm-Platten (Bordet-Gengou-Agar-Platten, ergänzt mit 10 % defibriniertem Schafsblut und 100 μg/ml Streptomycin) (Abbildung 2A). Lege die Platten in den 37 °C Inkubator und züchte sie 4 Tage lang. Zählen und berechnen Sie die KBEs aus dem Inokulum, das der Maus zugeführt wird (Abbildung 2B).
>3. Entnahme von tierischem Gewebe nach Infektion
- Bereiten Sie sich auf die Mausdissektion und die Gewebeentnahme vor.
- Sterilisieren Sie alle Werkzeuge (grobe und feine Scheren, gebogene Scheren, feine Zangen, Pelletstößel und Dreiecksspreizer), die für die Verarbeitung von Geweben in einem Autoklaven benötigt werden. Verschließen Sie die Werkzeuge in Sterilisationsbeuteln. Wickeln Sie die Glas-Dounce-Homogenisatoren in Folie ein und fügen Sie Autoklavenband hinzu, um die Sterilität anzuzeigen.
- Bereiten Sie die Agarplatten 1 oder 2 Tage vor der Gewebeentnahme vor, um sicherzustellen, dass die Platten vor der Verwendung verfestigt sind. Für B. pertussis sind 10 % BG + Sm. Etikettenplatten für die Lunge für jede Maus mit den gewünschten Verdünnungen zu verwenden, die für jedes Experiment empirisch bestimmt wurden.
- Füllen und etikettieren Sie KBE-Verdünnungsröhrchen. Geben Sie 0,9 ml steriles PBS in sterile 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, basierend auf der Anzahl der zu verarbeitenden Organe und den Verdünnungen pro Organ.
- Befüllen und Etikettieren von Röhrchen für die Gewebeentnahme:
- Lunge: 2 ml steriles 1%iges Kasein in PBS in ein steriles konisches 15-ml-Röhrchen geben und bei 4 °C lagern. Um Lungen für die Histologie zu gewinnen, fügen Sie 2 ml 10% neutrales gepuffertes Formalin (NBF) hinzu und lagern Sie es bei RT.
- Frisches 70%iges Ethanol sollte zum Befüllen von Bechern und Sprühflaschen zum Sezieren vorbereitet werden.
- Transportieren Sie alle Materialien am Tag der Ernte auf einem Wagen zum Vivarium. Reinigen Sie das BSC und richten Sie das Anästhesiegerät wie in den Schritten 1.3 und 1.4 ein.
- Legen Sie die zu präparierenden Mäuse in die Induktionskammer und schalten Sie bei fließendem Sauerstoff das Isofluran auf 5 % ein und warten Sie, bis die Tiere bewusstlos sind. Entfernen Sie die Mäuse nacheinander und verrenken Sie das Tier zervikal als sekundäre Methode, um den Tod sicherzustellen. Nach der zervikalen Luxation sollte die Euthanasie durch das Fehlen einer Atemfrequenz und/oder das Fehlen des Entzugsreflexes (Zehenquetschtest) bestätigt werden.
- Positionieren Sie die Maus mit der Bauchseite nach oben auf dem Sezierbrett und stecken Sie die Arme und Beine auf. Sprühen Sie den Körper der Maus mit 70% Ethanol ein.
- Fassen Sie mit einer Pinzette die Haut unterhalb des Bauches in der Mitte des Beckens an. Machen Sie mit einer scharfen Schere einen vertikalen Schnitt bis zum Unterkiefer. Präparieren Sie dann die Haut von der Peritonealwand weg, indem Sie die beiden Schichten mit kleinen Bewegungen bei geschlossener Schere auseinander drücken. Legen Sie die Haut an die Seiten des Kadavers, um ein ungehindertes Feld für die sterile Organentnahme zu schaffen.
- Stabilisieren Sie den Brustkorb mit einer Pinzette am Xiphoid-Prozess und schneiden Sie das Zwerchfell auf. Die Lungen sollten sich entleeren und in Richtung Wirbelsäule abfallen. Den Brustkorb an den Seiten aufschneiden, um den Vorderzeug zu entfernen.
- Isolieren und entfernen Sie den oberen Lappen der rechten Lunge, indem Sie die Lungenarterien und Venen durchtrennen. Legen Sie den Lappen in ein konisches 15-ml-Röhrchen mit 10 % NBF und platzieren Sie das Röhrchen mindestens 24 Stunden lang bei RT, um das Gewebe zu fixieren. Isolieren Sie die verbleibenden Lappen der rechten Lunge und der linken Lunge. Legen Sie die Lappen in ein konisches 15-ml-Röhrchen, das 2 mL 1% Kasein in PBS enthält, und legen Sie es auf Eis.
- Entsorgen Sie den Schlachtkörper in einem Biohazard-Beutel. Bevor Sie das nächste Tier sezieren, spülen Sie die Werkzeuge mit entionisiertem Wasser ab und legen Sie sie dann in ein Becherglas, das mit 70% Ethanol gefüllt ist. Entfernen Sie die Werkzeuge, schütteln Sie überschüssiges Ethanol ab und fahren Sie dann mit der nächsten Dissektion fort.
- Zerlegen Sie jede Maus mit den oben genannten Schritten.
- Verarbeiten Sie das Gewebe wie unten beschrieben.
>4. Verarbeitung der Lunge
- Übertragen Sie die Lunge (in 2 ml 1 % Kasein in PBS) in einen sterilen 15 ml Dounce Homogenisator. Verwenden Sie einen Stößel, um das Gewebe zu homogenisieren. Dissoziieren, bis keine großen Gewebepartikel mehr übrig sind. Legen Sie die homogenisierte Suspension wieder in das ursprüngliche 15-ml-Röhrchen.
- Entfernen Sie ein 0,3 mL Aliquot für die Beschichtung von KBE und zentrifugieren Sie das Homogenat bei 450 x g für 5 min bei 4 °C. Sammeln Sie den Überstand und aliquotieren Sie ihn in 0,5 mL Aliquoten in vormarkierte Mikrozentrifugenröhrchen. Lagern Sie die Proben bei -20 °C bis zur Analyse der Zytokine mittels ELISA.
- Bereiten Sie ausgewählte Verdünnungen vor, indem Sie 0,1 ml der homogenisierten Lungensuspension seriell in Verdünnungsröhrchen verdünnen (0,9 ml steriles PBS). 0,1 mL empirisch ausgewählter Verdünnungen auf vormarkierte 10 % BG + Sm-Platten auffüllen und mit einem sterilen Dreiecksstreuer verteilen.
- Inkubieren Sie die Platten bei 37 °C an der Raumluft für 4 Tage.
- Zählen und berechnen Sie KBEs/Lunge (Abbildung 3). Kurz gesagt, multiplizieren Sie die gewonnenen KBE-Zahlen mit dem Verdünnungsfaktor der Platte, dann auch mit dem Gesamtvolumen, in dem das Organ bearbeitet wurde. Die KBE-Berechnungen werden dann für jedes Tier in Log10-Werte umgewandelt und grafisch dargestellt.
- Platten mit 30-300 Völkern werden einfach und genau gezählt. Platten mit weniger als 6 Völkern sollten nicht für Berechnungen verwendet werden, da solch niedrige Völkerzahlen Fehler verursachen. Um eine untere Nachweisgrenze zu erhalten, wird das Gesamtvolumen, in dem ein Organ homogenisiert wurde, durch das Volumen dividiert, das verwendet wird, um das unverdünnte Homogenat auf eine Platte aufzuleuchten (z. B. 2 ml Gesamtvolumen geteilt durch 0,1 ml unverdünntes Homogenat entspricht der unteren Grenze von 20 nachweisbaren KBE).
