HINWEIS: Die folgenden Schritte wurden mit IIA1.6 B-Zellen durchgeführt.
>1. B-Zell-Aktivierung mit antigenbeschichteten Kügelchen
- Herstellung von antigenbeschichteten Kügelchen
- Um B-Zellen zu aktivieren, verwenden Sie NH 2-Kügelchen, die kovalent mit Antigen beschichtet sind (Ag-beschichtete Kügelchen), die unter Verwendung von 50 μl (~20 x 106 Kügelchen) von 3 μm NH2 -Kügelchen mit aktivierenden (BCR-Ligand+) oder nicht-aktivierenden (BCR-Liganden-) Antigenen hergestellt werden.
- Für IIA1.6 B-Zellen wird das anti-IgG-F(ab')2-Fragment als BCR-Ligand+ und das anti-IgM-F(ab')2 oder Rinderserumalbumin (BSA) als BCR-Ligand- verwendet. Um primäre B-Zellen oder IgM+ B-Zelllinien zu aktivieren, verwenden Sie anti-IgM-F(ab')2 als BCR-Ligand+ und BSA als BCR-Ligand-.
Anmerkung: Um die Bindung von Liganden an den Fc-Rezeptor zu vermeiden, verwenden Sie F(ab') oder F(ab')2 Antikörperfragmente anstelle von Antikörpern in voller Länge.
- Um mit der Herstellung von Ag-beschichteten Kügelchen fortzufahren, legen Sie die Kügelchen in Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Proteinbindung, um die Rückgewinnung der Kügelchen während der Probenmanipulation zu maximieren. 1 mL 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) zu den Waschperlen geben und 5 min bei 16.000 x g zentrifugieren. Aspirieren Sie den Überstand.
- Resuspendieren Sie die Kügelchen mit 500 μl 8 % Glutaraldehyd, um die NH2-Gruppen zu aktivieren, und drehen Sie sie 4 h lang bei Raumtemperatur (RT).
Vorsicht: Die Glutaraldehyd-Stammlösung sollte nur in einem chemischen Abzug verwendet werden. Befolgen Sie die Anweisungen auf dem Sicherheitsdatenblatt (MSDS).
- Zentrifugieren Sie die Kügelchen bei 16.000 x g für 5 min, entfernen Sie das Glutaraldehyd und waschen Sie die Kügelchen noch dreimal mit 1 mL 1x PBS.
Vorsicht: Die Glutaraldehydlösung sollte als chemischer Sondermüll entsorgt werden.
- Resuspendieren Sie die aktivierten Kügelchen in 100 μl 1x PBS. Die Probe kann in zwei Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Proteinbindung aufgeteilt werden: 50 μl für den BCR-Liganden+ und 50 μl für BCR-Liganden-.
- Zur Herstellung der Antigenlösung werden zwei 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Proteinbindung verwendet, die 100 μg/ml Antigenlösung in 150 μl PBS enthalten: Ein Röhrchen mit BCR-Ligand+ und das andere mit BCR-Ligand-.
- Geben Sie 50 μl aktivierte Beadslösung in jedes Röhrchen mit 150 μl Antigenlösung, wirbeln Sie es vor und drehen Sie es über Nacht bei 4 °C.
- 500 μl 10 mg/ml BSA zugeben, um die verbleibenden reaktiven NH2-Gruppen auf den Kügelchen zu blockieren, und 1 h bei 4 °C drehen.
- Die Kügelchen bei 16.000 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand entfernen. Waschen Sie die Kügelchen noch dreimal mit kaltem 1x PBS.
- Resuspendieren Sie die aktivierten Kügelchen in 70 μl 1x PBS.
- Um die Endkonzentration von Ag-beschichteten Kügelchen zu bestimmen, verdünnen Sie ein kleines Volumen der Kügelchen in PBS (1:200) und zählen Sie mit einem Hämozytometer. Anschließend bis zur Verwendung bei 4 °C lagern.
Anmerkung: Ag-beschichtete Kügelchen sollten nicht länger als 1 Monat gelagert werden.
>2. Herstellung von Poly-L-Lysin-Deckgläsern
- Bereiten Sie vor dem B-Zell-Aktivierungsassay mit Ag-beschichteten Kügelchen Poly-L-Lysin-beschichtete Deckgläser (PLL-Deckgläser) vor. Verwenden Sie ein 50-ml-Röhrchen mit 40 ml 0,01 % w/v PLL-Lösung und tauchen Sie die Deckgläser mit einem Durchmesser von 12 mm in die Lösung. Rotieren Sie über Nacht bei RT.
- Waschen Sie die Deckgläser mit 1x PBS und lassen Sie sie auf einem mit Paraffinfolie bedeckten 24-Well-Plattendeckel trocknen. Fahren Sie mit der Aktivierung der B-Zellen fort.
>3. Aktivierung von B-Zellen
- Um die B-Zell-Aktivierung mit Kügelchen zu starten, verdünnen Sie zunächst die IIA1.6 B-Zelllinie auf 1,5 x 106 Zellen/ml in CLICK-Medium (RPMI-1640 ergänzt mit 2 mM L-Alanin-L-Glutamin + 55 μM Beta-Mercaptoethanol + 1 mM Pyruvat + 100 U/ml Penicillin + 100 μg/ml Streptomycin) + 5 % hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum [FBS]).
- Kombinieren Sie 100 μl (150.000 Zellen) IIA1,6 B-Zellen mit Ag-beschichteten Kügelchen im Verhältnis 1:1 in 0,6 ml-Röhrchen. Vorsichtig mit einem Wirbel mischen und auf PLL-Deckgläser entkernen. Inkubieren Sie zu verschiedenen Zeitpunkten in einem Zellkultur-Inkubator (37 °C / 5% CO2). Die typischen Aktivierungszeitpunkte sind 0, 30, 60 und 120 Minuten. Legen Sie die PLL-Deckgläser für die Zeit 0 auf Eis in den 24-Well-Plattendeckel. Fügen Sie die mit Zell-Ag-beschichtete Kügelchenmischung hinzu und inkubieren Sie sie 5 Minuten lang auf Eis.
Anmerkung: Es ist wichtig, mit dem Wirbel zu mischen, anstatt auf und ab zu pipettieren, da dies die Anzahl der Kügelchen in der Probe verringern könnte, da sie sich in der Kunststoffspitze der Pipette ansammeln. Verwenden Sie mit BCR-Ligand- beschichtete Kügelchen als Negativkontrolle für jeden Assay. Wir empfehlen, zuerst die längste Inkubationszeit und dann die folgenden Zeitpunkte zu aktivieren. Die Aktivierungsintervalle für Proben sind so zu berechnen, dass sie gleichzeitig zur Fixierung bereit sind.
- Geben Sie 100 μl kaltes 1x PBS zu jedem Deckglas, um die Aktivierung zu stoppen und mit dem Immunfluoreszenzprotokoll fortzufahren.
