B-Zell-Aktivierung auf einem antigenbeschichteten Deckglas

Zusammenfassung

Quelle: Ibañez-Vega, J., et al., Untersuchung der Organellendynamik in B-Zellen während der Immunsynapsenbildung. J. Vis. exp. (2019)

Dieses Video zeigt die Aktivierung von B-Zellen in vitro. Der Prozess beinhaltet eine Antigeninteraktion mit B-Zell-Rezeptoren, die zum Umbau des Zytoskeletts, zur Bildung von Immunsynapsen, zur Bewegung von Lysosomen, zur Antigeninternalisierung, zur Verarbeitung und anschließenden Präsentation auf MHC-Molekülen zur B-Zell-Aktivierung führt.

Protokoll

>1. Herstellung von Poly-L-Lysin-Deckgläsern

1. Bereiten Sie vor dem B-Zell-Aktivierungsassay mit Ag-beschichteten Kügelchen Poly-L-Lysin-beschichtete Deckgläser (PLL-Deckgläser) vor. Verwenden Sie ein 50-ml-Röhrchen mit 40 ml 0,01 % w/v PLL-Lösung und tauchen Sie die Deckgläser mit einem Durchmesser von 12 mm in die Lösung. Rotieren Sie über Nacht bei RT.
2. Waschen Sie die Deckgläser mit 1xPBS und lassen Sie sie auf einem mit Paraffinfolie bedeckten 24-Well-Plattendeckel trocknen. Fahren Sie mit der Aktivierung der B-Zellen fort.

>2. B-Zell-Aktivierung auf antigenbeschichteten Deckgläsern

1. Erstellung von antigenbeschichteten Deckgläsern
   1. Bereiten Sie vor der Aktivierung die Antigenlösung vor (1x PBS mit 10 μg/ml BCR-Ligand+ und 0,5 μg/ml Ratten-Anti-Maus CD45R/B220).
   2. HINWEIS: Erwägen Sie, die Deckgläser am Tag vor dem Assay vorzubereiten. B220 verbessert die B-Zell-Adhäsion, jedoch reicht der BCR-Ligand+ aus, um die Spreizreaktion zu erzeugen.
   3. Legen Sie das 12-mm-Deckglas auf einen mit Paraffinfolie bedeckten 24-Well-Plattendeckel, geben Sie 40 μl Antigenlösung auf jedes Deckglas und inkubieren Sie es über Nacht bei 4 °C. Verschließen Sie die Platte, um eine Verdunstung der Antigenlösung zu vermeiden.
   4. Waschen Sie die Deckgläser mit 1x PBS und trocknen Sie sie an der Luft.
2. Aktivierung der B-Zellen
   1. Um die Aktivierung zu starten, verdünnen Sie IIA1,6 B-Zellen auf 1,5 x 10⁶ Zellen/ml in CLICK-Medium + 5 % FBS.
   2. 100 μL Zellen auf ein antigenbeschichtetes Deckglas (Ag-Deckglas) geben und für unterschiedliche Zeitpunkte in einem Zellinkubator bei 37 °C / 5% CO₂ aktivieren. Die typischen Aktivierungszeitpunkte sind 0, 30 und 60 min.
      Anmerkung: Wie in Abschnitt 1 empfehlen wir, mit dem längsten Aktivierungszeitpunkt zu beginnen, um alle Samples gleichzeitig zu fixieren.
   3. Für die Zeit 0 legen Sie den 24-Well-Plattendeckel mit dem Ag-Deckglas auf Eis und fügen Sie die Zellen hinzu. 5 Minuten auf Eis inkubieren.
   4. Saugen Sie das Medium vorsichtig auf jedem Ag-Deckglas an und fügen Sie dann 100 μl kaltes 1x PBS hinzu, um die Aktivierung zu stoppen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
IIA1.6 (A20-Variante) B-Lymphomzellen der Maus	ATCC	TIB-208	Murines B-Zell-Lymphom Balb/c-Ursprungs, das auf seiner Oberfläche ein IgG-haltiges BCR ohne FcγIIR exprimiert
CaCl2	Winkler	CA-0520
Glycin	Winkler	BM-0820
HyClone Fötales Rinderserum	Thermo Fisher Scientific	SH30071.03	Hitze für 30 min bei 56 °C inaktivieren
Kcl	Winkler	PO-1260
NaCl	Winkler	SO-1455
Parafilm	M	Nr. P1150-2
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122	Flüssigkeit
Poly-L-Lysin	Sigma	Nr. P8920	Mit sterilem Wasser verdünnen
RPMI-1640	Biologische Industrien	01-104-1A
Natriumpyruvat	Thermo Fisher Scientific	11360070
Tube 50 ml	Corning	353043
2-Mercaptoethanol	Thermo Fisher Scientific	21985023
Glutamin	Thermo Fisher Scientific	35050061
Ziegen-Anti-Maus-IgG-Antikörper	Jackson Immunforschung	Artikel-Nr.: 315-005-003	IIA1.6 positiver Ligand