>1. Erzeugung von BMM
- 1 x 107 Zellen/10 mL in eine 10 cm Kulturschale geben und M-CSF 100 ng/mL zugeben. Die Endkonzentration von M-CSF beträgt 100 ng/ml Kulturmedium. Inkubieren Sie die Kultur 3 Tage lang bei 37 °C, 5 % CO2.
- Entfernen Sie nach 3 Tagen das Kulturmedium, waschen Sie die Zellen zweimal kräftig mit 10 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), um nicht adhärente Zellen zu entfernen, fügen Sie 5 ml Raumtemperatur 0,02 % Trypsin-EDTA in PBS hinzu und inkubieren Sie bei 37 °C 5 % CO2 für 5 Minuten.
- Trennen Sie die Zellen durch gründliches Pipettieren. Stellen Sie sicher, dass die Zellen abgelöst wurden, indem Sie die Kultur unter einem Mikroskop beobachten (die Zellen sollten rund erscheinen und im Medium schweben). Wenn die Zellen anhaften, wiederholen Sie das gründliche Pipettieren, um sie zu lösen. Wenn die Zellen abgelöst wurden, fügen Sie 5 ml α-MEM hinzu, um die Reaktion zu inaktivieren.
- Sammeln Sie die Zellen in ein konisches 50-ml-Röhrchen und zentrifugieren Sie sie 5 Minuten lang bei 300 x g. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie ihn mit 5 ml α-MEM.
- Zentrifugieren Sie 5 min lang bei 300 x g und resuspendieren Sie das Pellet in 10 mL α-MEM.
- Führen Sie eine Zellzählung durch.
- 1 x 106 Zellen/10 mL in eine 10 cm Kulturschale aussäen und M-CSF 100 ng/mL zugeben. Die Endkonzentration von M-CSF beträgt 100 ng/ml Kulturmedium. Inkubieren Sie die Kultur 3 Tage lang bei 37 °C, 5 % CO2.
>2. Erzeugung von Osteoklasten aus BMM als Osteoklasten-Vorläufer
- Ernten Sie nach 3 Tagen die angehängten Zellen, die BMM als Osteoklastenvorläufer darstellen, indem Sie die Schritte 1.2-1.7 befolgen.
- Aussaat von BMM in 5 x 104 Zellen/200 μl α-MEM in einer 96-Well-Platte. Fügen Sie RANKL für eine Endkonzentration von 50 ng/ml oder TNF-α für eine Endkonzentration von 100 ng/ml hinzu. Geben Sie M-CSF für eine Endkonzentration von 100 ng/ml in jede Vertiefung.
- Geben Sie einen Anti-c-fms-Antikörper (Endkonzentrationen von 0, 1, 10, 100, 1000 ng/ml) in jede Vertiefung
.
Bei - 37 °C, 5 % CO2 4 Tage inkubieren. Wechseln Sie das Medium 4 Tage lang jeden zweiten Tag.
>3. Tartratresistente saure Phosphatase (TRAP) Färbung
- Nach 4-tägiger Inkubation wird das Nährmedium jeder Vertiefung vorsichtig abgesaugt. Waschen Sie jede Mulde einmal mit 200 μl Raumtemperatur 1x PBS.
- 200 μl 10%iges Formalin zur Fixierung in jede Vertiefung geben und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren. Aspirieren Sie das Formalin und waschen Sie jede Mulde 3 Mal mit entionisiertem Wasser.
- 200 μl 0,2 % Triton X-100 in PBS zur Permeabilisierung in jede Vertiefung geben und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren. Aspirieren Sie den Triton X-100 und waschen Sie jede Probe 3 Mal gut mit entionisiertem Wasser.
- Geben Sie 200 μl TRAP-Fleckenlösung in jede Vertiefung. Visualisieren Sie den Fleck unter dem Mikroskop. Es dauert 10-30 Minuten, bis sich der Fleck richtig entwickelt hat.
- Saugen Sie den Fleck ab und waschen Sie jede Vertiefung 3 Mal mit entionisiertem Wasser und trocknen Sie sie an der Luft. Bewahren Sie es bei Raumtemperatur auf, um es für weitere Beobachtungen zu verwenden.
