>1. Virusinfektion bei Drosophila
- Infizieren Sie Fliegen durch Nanoinjektion und führen Sie Überlebenstests durch.
- Ziehen Sie an den Kapillaren, um die Injektionsnadeln vorzubereiten, füllen Sie die Injektionsnadel mit Öl zurück und bauen Sie den Injektor zusammen.
- Betäubungsmittelfliegen auf dem Pad unter einem leichten Fluss von CO2. Fliegen durch intrathorakale Injektion von 50,6 nL Viruslösung (100 PFU, verdünnt mit Tris-HCl-Puffer, pH 7,2) impfen. Injizieren Sie mindestens 3 Durchstechflaschen mit Fliegen (20 Fliegen pro Durchstechflasche).
Anmerkung: Die Injektion ist zeitaufwändig (in der Regel 100 Fliegen pro Stunde) und die Replikation des Drosophila-C-Virus (DCV) erfolgt sehr schnell, daher ist es sehr wichtig, die genaue Uhrzeit auf dem Röhrchen zu notieren, sobald jedes Fläschchen (20 Fliegen) fertig ist. Die Nur-Puffer-Injektion wird als simuliertes Steuerelement festgelegt. In der Regel werden männliche adulte Fliegen bevorzugt, da die Ergebnisse stabiler und reproduzierbarer sind als bei der Verwendung von Weibchen, da hormonelle Schwankungen während der Paarung und Fortpflanzung die Auslesung der Weibchen beeinflussen können.
- Züchten Sie die injizierten Fliegen bei 25 °C und 60 % Luftfeuchtigkeit unter einem normalen Hell-Dunkel-Zyklus. Versorgungsen Sie die Fliegen täglich mit frischem Futter und notieren Sie die Anzahl der toten Fliegen.
- Führen Sie mindestens 3 biologische Replikate durch und zeichnen Sie die Überlebenskurve auf.
- Für die statistische Analyse von Überlebensdaten generieren Sie Kaplan-Meier-Überlebenskurven mit einer Statistiksoftware. Führen Sie einen Log-Rank-Test durch, um die P-Werte zu berechnen. Geben Sie in der Überlebenstabelle Informationen für jedes Subjekt ein. Die Software berechnet dann jedes Mal das prozentuale Überleben und zeichnet ein Kaplan-Meier-Überlebensdiagramm auf.
Anmerkung: Geben Sie KEINE zusätzliche Hefe in die Durchstechflasche. Im Vergleich zu Scheinkontrollen haben DCV-infizierte Fliegen gelegentlich Aszites und sind ungeschickt, was sie anfällig für klebrige Hefe macht. Besser ist es, im Vorversuch mehr Zeitpunkte aufzuzeichnen, um einen Zeitrahmen herauszufinden, in dem der Massentod bei infizierten Fliegen stattfinden wird. Im Allgemeinen sterben die infizierten Fliegen selten innerhalb der ersten zwei Tage, selbst bei den Dicer-2-Mutantenlinien. Bei der Wolbachia-freien Fliege w1118 (Bloomington 5905), die mit 100 PFU DCV infiziert ist, liegt dieses Zeitfenster bei etwa 3-5 Tagen nach der Infektion. Fruchtfliegen, die innerhalb von 0,5 Stunden nach der Injektion sterben, sollten nicht als Todesfall gezählt werden, da sie möglicherweise durch Nadelverletzung und nicht durch Virusinfektion getötet werden.
>2. Messung der DCV-Belastung durch CPE-Assay (Cytopathic Effect)
- Infizieren Sie an Tag 1 männliche Fliegen, wie in den Schritten 1.1.1 bis 1.1.2 beschrieben. Gruppieren Sie die injizierten Fliegen in Gruppen von 20 Fliegen und lassen Sie sie für die gewünschte Zeit (typischerweise 24 h oder 3 Tage) auf frischem Fliegenfutter wachsen. Versorgen Sie die Fliegen täglich mit frischem Futter.
- An Tag 2 werden Drosophila S2*-Zellen in einer 10-cm-Zellkulturschale auf eine Dichte von etwa 5 x106 bis 1x107 Zellen/ml ausgesät.
- An Tag 3 werden 5 Fliegen (unter leichtem CO2 -Fluss) gesammelt und in einem 1,5 mL Zentrifugenröhrchen 30 s lang mit 200 μl Tris-Puffer und Keramikkügelchen mit einem Homogenisator zerkleinert. Lagern Sie die Proben bei -80 °C oder fahren Sie sofort mit dem nächsten Schritt fort.
- Wirbeln Sie die Probe gründlich ein. Verwenden Sie eine 1-ml-Spritze und einen 0,22-μm-Filter, um den Überstand in ein neues 1,5-ml-Röhrchen zu filtern.
- Führen Sie serielle 10-fache Verdünnungen des Überstands mit vollständigem Medium für S2*-Zellen durch. 50 μl Verdünnungen in die Vertiefung geben. 50 μl Kulturmedium ohne Viren werden in die Vertiefung gegeben, die als Negativkontrollvertiefung eingestuft ist.
Anmerkung: Für jede Verdünnungsrate wurden 8 Wells verwendet. Da die typische DCV-Ausbeute bei etwa 108-10 9 PFU/ml liegt, sollte die Verdünnung mindestens ~10-5-10-10 abdecken.
- Beobachten Sie CPE an Tag 4 mit einem Hellfeldmikroskop mit einem 20X- oder 40X-Objektiv. Klassifizieren Sie eine Vertiefung, in der die Zellen verschwommen aussehen und das Medium voller Fragmente ist, als "positive Vertiefung", und eine Vertiefung, in der die Zellmorphologie normal ist, als "negative Vertiefung".
- Markieren Sie CPE-positive oder -negative Wells mit + bzw. –. Berechnen Sie die durchschnittliche infektiöse Dosis der Virusgewebekultur (TCID50).
>3. DCV-Belastung gemessen durch qRT-PCR
- Infizieren Sie Fliegen an Tag 1 wie oben beschrieben. Die Gruppe injiziert männliche Fliegen (20 Fliegen/Gruppe) und züchtet sie für die gewünschte Zeit, typischerweise für 24 Stunden oder 3 Tage, mit frischem Fliegenfutter. Versorgen Sie die Fliegen täglich mit frischem Futter.
- An Tag 3 werden 5 Fliegen unter leichtem CO2 -Gehalt in einem 1,5-ml-Röhrchen mit 200 μl Lysepuffer und 20 Keramikkügelchen (Durchmesser = 0,5 mm) gesammelt und die Proben mit einem Homogenisator bei hoher Geschwindigkeit 30 s lang gemahlen. Geben Sie 800 μl zusätzlichen Lysepuffer in jedes Röhrchen und lagern Sie die Proben bei -80 °C oder führen Sie sofort eine RNA-Extraktion und qRT-PCR durch.
- Bereiten Sie RNase-freie Spitzen, Röhrchen und deionisiertes, mit Diethylpyrocarbonat (DEPC) behandeltes und membrangefiltertes Wasser mit 0,22 μm vor. Geben Sie 200 μl Chloroform (≥99,5%) in die Probe und schütteln Sie sie 15 s lang kräftig von Hand. 5 min oder länger bei Raumtemperatur inkubieren, bis die Wasserphase und die organische Phase klar voneinander getrennt sind.
Anmerkung: Chloroform ist äußerst gefährlich und muss mit Vorsicht behandelt werden. Wirbeln Sie die Probe NICHT ein, da dies das Risiko einer DNA-Kontamination erhöht.
- Zentrifugieren Sie Proben bei 13.000 x g für 15 min bei 4 °C.
- 400 μl Überstand auffangen und den Überstand in neue Röhrchen umfüllen. Mischen Sie mit der gleichen Menge Isopropanol (≥ 99,5%), drehen Sie die Proben vorsichtig 20 Mal von Hand um und fallen Sie dann 10 Minuten oder länger bei Raumtemperatur aus.
Anmerkung: Eine Fällung bei -20 °C erhöht die RNA-Ausbeute.
- Zentrifugieren Sie Proben bei 13.000 x g für 10 min bei 4 °C. Weiße RNA-Kügelchen sind am Boden des Röhrchens sichtbar.
- Entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie 1 ml 70%iges Ethanol (Ethanol in DEPC-Wasser) hinzu und invertieren Sie es einige Male, um die RNA zu waschen.
- Zentrifugieren Sie die Proben bei 13.000 x g für 5 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand und die trockene RNA für 5-10 min. RNA soll transparent werden.
- Geben Sie 50 μl DEPC-Wasser in die Probe, pipettieren Sie sie einige Male und wirbeln Sie sie ein.
- Nehmen Sie 3 μl RNA zur Titration der RNA-Konzentration. Quantifizieren Sie die RNA bei 260 nm. Normalerweise beträgt die mit diesem Protokoll extrahierte RNA-Konzentration etwa 100-500 μg/μl, was für die cDNA-Synthese geeignet ist.
- Verwenden Sie 2 μg RNA für die cDNA-Synthese. Die Probe wird mit ddH2O auf 100 μl verdünnt und bei -20 °C gelagert.
- Führen Sie die qRT-PCR gemäß den Anweisungen des Herstellers durch und führen Sie qRT-PCR.
Anmerkung: Für die cDNA-Synthese von DCV funktionierten zufällige Primer viel besser als Poly-A-Primer. Die DCV-mRNA-Expression ist auf endogene ribosomale Protein 49 (rp49) mRNA normalisiert. Oligonukleotid-Primer, die in diesem Teil verwendet werden:
rp49 5' AGATCGTGAAGAAGCGCACCAAG 3' (vorne) und
5' CACCAGGAACTTCTTGAATCCGG 3' (Rückseite);
DCV, 5' TCATCGGTATGCACATTGCT 3' (vorne) und
5' CGCATAACCATGCTCTTCTG 3' (Rückseite);
vago, 5' TGCAACTCTGGGAGGATAGC 3' (vorne) und
5' AATTGCCCTGCGTCAGTTT 3' (Rückseite);
virusinduzierte RNA 1 (vir-1) 5' GATCCCAATTTTTTCCCATCAA 3' (vorwärts) und
5' GATTACAGCTGGGTGCAA 3' (Rückseite).