Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Vorbereitung von Mäusen und DSS
- Halten Sie die Knockout-Mäuse (α-Gustducin-/-) und die auf Alter, Geschlecht und Körpergewicht abgestimmten Wildtyp-Kontrollmäuse (α-Gustducin+/+) C57BL/6 einzeln in sauberen Käfigen.
Anmerkung: Die Knockout-Mäuse werden seit über 20 Generationen mit C57BL/6-Mäusen rückgekreuzt und haben einen nahezu 100%igen genetischen Hintergrund von C57BL/6.
- 30 g Dextransulfat-Natrium (DSS)-Pulver in 1 l autoklaviertem Wasser auflösen. Mischen, bis die Lösung klar wird, um sicherzustellen, dass die endgültige Arbeitskonzentration 3 % (w/v) beträgt.
Anmerkung: Die DSS-Lösung kann bis zu 1 Woche bei Raumtemperatur oder bis zur Verwendung bei 4 °C gelagert werden.
>2. Induktion und Bewertung von DSS-Colitis bei Mäusen
- Wiegen und notieren Sie das anfängliche Körpergewicht jeder Maus. Setzen Sie die Mäuse einzeln in handelsübliche Kunststoffkäfige und beschriften Sie die Käfige.
- Ersetzen Sie normales Trinkwasser durch 3%ige DSS-Lösung für insgesamt 7 Tage, zu denen beide Gruppen von Mäusen ad libitum Zugang haben.
- Messen Sie das Körpergewicht der Maus, zeichnen Sie den Verbrauch der DSS-Lösung auf und sammeln und untersuchen Sie täglich den Stuhl jeder Maus während der DSS-Verabreichung. Beobachten Sie die Schwere von Durchfall und rektalen Blutungen und rechnen Sie diese in den DSS-induzierten Krankheitsindex um.
- Während des Experiments werden der prozentuale Gewichtsverlust im Vergleich zum Ausgangsgewicht und der Krankheitsindex berechnet, um die Symptome der Kolitis zu bewerten.
Anmerkung: Der Krankheitsindex wird durch die Kombination von Beobachtungen von Durchfall und rektalen Blutungen bewertet und ist wie folgt definiert: 0 (normaler Stuhl, kein Blut), 1 (weicher Stuhl, kein Blut), 2 (weicher Stuhl, wenig Blut), 3 (sehr weicher Stuhl, leichte Blutung) und 4 (wässriger Stuhl, starke Blutungen). Der Krankheitsindex wird täglich für jede Maus analysiert.
- Am Ende der 7-tägigen DSS-Behandlung töten Sie die Mäuse durch Gebärmutterhalsluxation und fahren Sie mit den verbleibenden Experimenten fort.
>3. Vorbereitung von Gewebeproben
- Bringen Sie die Maus in Rückenlage und reinigen Sie die Haut des Bauches mit 70% Ethanol. Machen Sie mit einer kleinen Schere einen 3 cm langen Schnitt in der Mittellinie, um die Bauchhöhle freizulegen.
- Trennen Sie die Milz vorsichtig mit einer Pinzette von anderen Geweben, entfernen Sie dann die Milz und messen Sie ihre Größe.
- Identifizieren und heben Sie den Dickdarm mit einer Pinzette an und trennen Sie ihn vom umgebenden Mesenterium. Ziehen Sie den gesamten Dickdarm heraus, bis der Blinddarm und der Enddarm sichtbar sind.
- Isolieren Sie den Dickdarm, indem Sie ihn am Kolozökalrand und tief im Becken durchschneiden, um den proximalen bzw. distalen Dickdarm zu befreien. Messen und notieren Sie dann die Länge des isolierten Doppelpunkts. Achten Sie darauf, das Dickdarmgewebe während des Präpariervorgangs nicht zu beschädigen.
- Spülen Sie den Dickdarm mit 10 ml eiskalter, phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit einer 10-ml-Spritze, die mit einer Sondennadel ausgestattet ist, um den Kot und das Blut zu entfernen, bis das Eluat vollständig frei ist.
- Für die histologische Identifizierung teilen Sie die Gewebeproben gleichmäßig in drei Teile auf: proximal, mittel und distal. Fixieren Sie das Gewebe dann über Nacht mit 4% Paraformaldehyd (PFA) bei 4 °C.
>4. Histologische Beurteilung des Schweregrads der DSS-induzierten Kolitis
- Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E)
- Tauchen Sie das Gewebe nach der Fixierung über Nacht in eine Lösung aus 30% Saccharose in 1x PBS in ein 15-ml-Röhrchen, um die Proben zu kryoschützen.
- Betten Sie das Gewebe in eine Mischung mit optimaler Schnitttemperatur (OCT) ein und legen Sie es bei -20 °C, bis das OCT aushärtet.
- Übertragen Sie den OCT-Block mit dem Gewebe in einen Kryostaten, stellen Sie den Dickenregler im Kryostaten auf 12 μm ein und schneiden und sammeln Sie 12 μm dicke Schnellschnitte.
- Erhitzen Sie die entnommenen Gewebeschnitte aus einem Kryostaten bei 65 °C für 20 min auf einer Heizplatte.
- Waschen Sie die Abschnitte kurz in destilliertem Wasser. Färben Sie sie 5 Minuten lang mit Hämatoxylin-Färbelösung und spülen Sie sie anschließend 5 Minuten lang mit fließendem Leitungswasser ab.
- Differenzieren Sie die Sektionen mit 0,5 % Salzsäure-Ethanol für 30 s und spülen Sie sie 1 min unter fließendem Leitungswasser ab. Führen Sie dann die Wäsche in 1x PBS für 1 min durch und spülen Sie anschließend 5 min lang mit fließendem Leitungswasser aus.
- Waschen Sie die Gewebeschnitte in 70%, 75%, 80% und 95% Alkohol jeweils 10 s lang. Gegenfärbung in Eosin-Färbelösung für 2 min.
- Führen Sie eine Dehydrierung durch 95% Alkohol und 2 Wechsel des absoluten Alkohols für jeweils 5 Minuten durch. In 2 Wechseln Xylol für 5 min klären.
Bewerten Sie die - Gewebeschädigung des proximalen, mittleren und distalen Dickdarms jeder Maus sowohl für die Gen-Knockout- als auch für die Wildtyp-Gruppe basierend auf den Ergebnissen der obigen H&E-Färbung.
Anmerkung: Der Krankheitsindex ist ein kombinierter Score aus Epithelschäden und Entzündungen in den Regionen Mukosa, Submukosa, Muscularis und Serosa, der wie folgt definiert ist: 0 (keine Gewebeschädigung und Entzündung), 1 (fokale Gewebeschädigung und Entzündung), 2 (fleckige Gewebeschädigung und Entzündung) und 3 (diffuse Gewebeschädigung und Entzündung). Drei Werte pro Maus für den proximalen, mittleren und distalen Teil des Dickdarms werden dann addiert, um eine Gesamtpunktzahl für jedes Tier zu erhalten. Anschließend werden die Durchschnittswerte für jede Gruppe berechnet.
