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Alle Eingriffe mit menschlichen Teilnehmern wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für das Wohlergehen des Menschen durchgeführt und vom lokalen institutionellen Prüfungsausschuss überprüft.
>1. Isolierung menschlicher Monozyten und Differenzierung in Makrophagen
- Entnahme von antikoaguliertem Blut von nicht identifizierten gesunden Personen in einer regionalen Blutbank und Isolierung von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) wie unten angegeben.
Anmerkung: Führen Sie alle Schritte in einer Laminar-Flow-Haube für Gewebekulturen durch. Verwenden Sie nur sterile Röhrchen und tragen Sie Handschuhe. Fügen Sie bei der Entsorgung 10 % Bleichmittel zu allen blutverwandten Produkten hinzu. Sterile phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) (1x) oder Dulbeccos phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS) (ohne Ca2+ und Mg2+) können austauschbar verwendet werden.
- Bereiten Sie den Verdünnungspuffer vor: Ergänzen Sie 1x steriles PBS mit 2% fötalem Rinderserum (FBS) und 0,5 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA).
- Bereiten Sie das Nährmedium vor: Ergänzen Sie das RPMI-1640-Medium mit FBS (10 % (v/v)), Glutamax (2 mM) und Penicillin/Streptomycin (50 I.E./50 μg/ml)
- Kühlen Sie den laufenden Puffer (Table of Materials) gemäß dem Protokoll des Herstellers vor.
- Vollblut mit zwei Volumina Verdünnungspuffer verdünnen. Übertragen Sie mit einer serologischen Pipette 15 ml des antikoagulierten Blutes in ein 50-ml-Röhrchen, das 30 ml des Verdünnungspuffers enthält. Vorsichtig durch Inversion mischen.
- Geben Sie für jeweils 10 ml Vollblut oder 30 ml verdünntes Blut 15 ml des Dichtegradientenmediums in ein leeres 50-ml-Röhrchen.
- Das Dichtegradientenmedium aus Schritt 1.1.5 wird mit einer serologischen 25-ml-Pipette langsam und gleichmäßig mit 30 mL verdünntem Blut übergossen. Halten Sie die Spitze der Pipette in einem geneigten Winkel an der Wand des Röhrchens und des Röhrchens.
- Übertragen Sie die Röhrchen vorsichtig in eine schwingende Eimerzentrifuge. Vermeiden Sie es, die beiden Phasen zu stören. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 400 x g bei Raumtemperatur (RT) für 25 min, wobei die Beschleunigung und Verzögerung auf den minimalen Wert eingestellt sind.
- Entfernen Sie vorsichtig die obere (klare) Plasmaschicht mit einer 10-ml-Pipette und entsorgen Sie sie in einem Behälter mit Bleiche (10%).
- Entnehmen Sie die (weiße) Interphase-Schicht der mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs, Abbildung 1) mit einer 10-ml-Pipette und geben Sie sie in ein frisches 50-ml-Röhrchen. Kombinieren Sie die weiße Schicht aus verschiedenen Röhrchen desselben Spenders in einem 50 mL Röhrchen bis zu 30 mL.
- Jedes Röhrchen mit dem Verdünnungspuffer aus Schritt 1.1.1 auf ein Gesamtvolumen von 50 mL bringen und bei 300 x g und 4 ΰC für 10 min zentrifugieren. Den Überstand mit einer 10-ml-Pipette entfernen und in einem Behälter mit Bleiche (10%) entsorgen.
- Jedes Zellpellet wird in 1 ml des vorgekühlten Laufpuffers aus Schritt 1.1.3 mit einer p1000-Mikropipette resuspendiert. Kombinieren Sie Zellsuspensionen desselben Spenders in einem neuen 15-ml-Röhrchen. Bringen Sie das Volumen jedes Röhrchens mit vorgekühltem Laufpuffer auf 15 mL und mischen Sie es gut durch Inversion.
- Nehmen Sie ein 20 μL Aliquot der Zellsuspension aus Schritt 1.1.11 und bereiten Sie eine 1:100 Verdünnung mit 1x sterilem PBS vor. Bestimmen Sie die Zellzahl mit einem Hämozytometer.
- Die Zellsuspension aus Schritt 1.1.11 bei 300 x g und 4 °C für 10 min zentrifugieren und den Überstand mit einer 10 mL Pipette entfernen. Falls erforderlich, verwenden Sie eine p200-Mikropipette, um den Überstand vollständig zu entfernen.
- Resuspendieren Sie die isolierten PBMCs in 80 μl vorgekühltem MACS-Laufpuffer für jede 1 x 107 Zelle, wobei Sie maximal 800 μl des Puffers addieren.
- Fügen Sie 20 μl anti-humane CD14-Mikrokügelchen pro je 1 x 107 Zellen oder bis zu 100 μl pro Blutprobe (~100 ml unverdünntes Blut) hinzu. Durch Inversion gut mischen und 20 min bei kontinuierlichem Mischen bei 4 °C auf einen Röhrenrotator stellen.
- Entnehmen Sie die Proben aus dem Röhrchenrotator, geben Sie 10 mL vorgekühlten Laufpuffer in jedes Röhrchen und zentrifugieren Sie 10 Minuten lang bei 300 x g (Beschleunigung = 5, Verzögerung = 5) und 4 °C.
- Den Überstand mit einer 10-ml-Pipette entfernen und bis zu 1 x 108 Zellen in 500 μl vorgekühltem Laufpuffer (2 x 108/ml) resuspendieren.
- Führen Sie die Isolierung von CD14-positiven Zellen durch magnetische Zellsortierung mit einem manuellen oder automatisierten System (Materialtabelle) gemäß den Anweisungen des Herstellers durch.
- Nach CD14-positiver Selektion wird ein aliquotes 20 μl der Zellsuspension aus Schritt 1.1.18 entnommen und eine Verdünnung im Verhältnis 1:100 mit 1x sterilem PBS hergestellt. Bestimmen Sie die Zellzahl, indem Sie die Zellen auf einem Hämozytometer zählen.
- Die CD14-positiven Zellen werden bei 300 x g und RT 10 min lang zentrifugiert. Der Überstand wird mit einer 10 mL Pipette oder einem Vakuumsystem entfernt.
- Das Zellpellet aus Schritt 1.1.20 wird in einem vorgewärmten Kulturmedium aus Schritt 1.1.2 auf eine endgültige Zelldichte von 1 x 107 Zellen/ml resuspendiert.
- Die isolierten CD14-positiven Monozyten werden mit einer Zelldichte von 5 x 106 Zellen ausgesiedelt.
- In eine 10 cm große Gewebekulturschale werden 10 ml Kulturmedium aus Schritt 1.1.2 gegeben, ergänzt mit 50 ng/ml Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF).
- 0,5 ml der Zellsuspension aus Schritt 1.1.21 tropfenweise in das Kulturmedium geben und die Platte vorsichtig schwenken. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht in einem befeuchteten Gewebekultur-Inkubator (37 °C, 5 % CO2).
- Am nächsten Tag saugen Sie das Medium mit einem Vakuumsystem ab, um Zellen zu entfernen, die sich nicht über Nacht anheftet haben. 10 ml frisches Kulturmedium mit GM-CSF (50 ng/ml) zugeben und die Zellen in einem befeuchteten Gewebekultur-Inkubator (37 °C, 5 % CO2) 7 Tage lang inkubieren, um eine vollständige Differenzierung zu ermöglichen (siehe Abbildung 2A für das Auftreten von CD14+-Monozyten in verschiedenen Stadien der Differenzierung bei GM-CSF). Tauschen Sie das Nährmedium alle 2-3 Tage aus und ergänzen Sie es jedes Mal mit frischem GM-CSF (50 ng/ml).
>2. Vorbereitung der Elektroporationskomponenten
HINWEIS: Dieses Protokoll ist für eine 10 μL-Neonspitze ausgelegt (Materialtabelle). Für jede Transfektion werden 1-2 x 105 Zellen verwendet. Es wird empfohlen, die transfizierten Zellen auf einer 48-Well-Platte oder einer 8-Well-Kammerschale (10 μl transfizierte Zellen pro Well) zu säen. Anstelle von PBS kann 1x steriles DPBS (ohne Ca2+ und Mg2+) verwendet werden.
- Bereiten Sie an Tag 7 ein antibiotikafreies Medium vor, indem Sie das RPMI-1640-Medium mit FBS (10 % (v/v)) und Glutamax (2 mM) ergänzen.
- Serumfreies RPMI-1640-Medium, Trypsin-EDTA-Lösung (0,25 %), 1x steriles PBS (ohne Ca2+ und Mg2+) und vollständiges Kulturmedium aus Schritt 1.1.2 in ein 37 °C heißes Wasserbad geben.
- Bei Verwendung von Schalen mit Glasboden (für die konfokale Mikroskopie) beschichten Sie die Schalen mit Poly-D-Lysinhydrobromid.
- Eine Schale mit 8 Well-Kammern mit 200 μl Poly-D-Lysinhydrobromid (0,1 mg/mL in 1x sterilem PBS) bestreichen und 5 Minuten bei RT inkubieren.
- Die Poly-D-Lysin-Lösung aspirieren und das Glas einmal mit 1x sterilem PBS waschen. Aspirieren Sie das PBS und fahren Sie mit Schritt 2.4 fort.
- Geben Sie 200 μl antibiotikafreies Medium pro Vertiefung der 48-Well-Platte oder der 8-Well-Kammer hinzu und inkubieren Sie sie in einem befeuchteten Gewebekultur-Inkubator (37 °C, 5 % CO2), bis die transfizierten Zellen plattiert werden können.
>3. Vorbereitung der Zellen für die Elektroporation
HINWEIS: Die Ausbeute an MDM aus einer 10-cm-Schale am Ende der 7-tägigen Differenzierungsperiode beträgt ungefähr 1,5 x 106 Zellen. 1x steriles DPBS (ohne Ca2+ und Mg2+) kann anstelle von PBS verwendet werden. Dieses Protokoll wurde so optimiert, dass die meisten Makrophagen unter Beibehaltung der Zellviabilität und -integrität von der Platte gelöst werden. MDM lässt sich nur schwer von Zellkulturplatten lösen. Daher kann es notwendig sein, die Schritte 3.2 und 3.3 zweimal durchzuführen, um die Zellen zu dissoziieren. Stellen Sie sicher, dass jede Inkubationszeit mit Trypsin-EDTA (0,25%) 5 Minuten nicht überschreitet.
- Aspirieren Sie das Medium von voll differenzierten Makrophagen auf 10 cm großem Geschirr und waschen Sie die Zellmonoschicht mit warmem, serumfreiem RPMI-1640-Medium. Achten Sie darauf, das Medium vollständig zu entfernen.
- Ernten Sie die Zellen, indem Sie 2 ml warme Trypsin-EDTA-Lösung (0,25 %) pro 10-cm-Schale hinzufügen und 5 Minuten lang in einem befeuchteten Gewebekultur-Inkubator (37 °C, 5 % CO2) inkubieren.
- Schließen Sie die Zellablösung ab, indem Sie die Trypsin-EDTA-Lösung (0,25 %) mit einer p1000-Mikropipette vorsichtig über den gesamten Schalenbereich auf und ab pipettieren. Die Zellsuspension wird in ein konisches 15-ml-Röhrchen überführt, das 5 ml warmes vollständiges Kulturmedium aus Schritt 1.1.2 enthält.
- Bringen Sie die Schüssel zu einem Hellfeldmikroskop und prüfen Sie, ob sich die Zellen in verschiedenen Sichtfeldern ablösen. Wenn noch eine beträchtliche Anzahl von Zellen angehängt ist, wiederholen Sie die Schritte 3.2-3.3.
- Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 250 x g für 5 min bei RT.
- Aspirieren Sie das Medium und resuspendieren Sie die Zellen in 10 mL 1x sterilem PBS, das auf 37 °C vorgewärmt wird. Nehmen Sie ein 20 μl Aliquot, um die Zellzahl mit einem Hämozytometer zu bestimmen.
- Nehmen Sie 1-2 x 105 Zellen pro beabsichtigter Transfektion und geben Sie sie in ein 15 mL Röhrchen. Auf ein Endvolumen von 15 mL mit vorgewärmtem 1x sterilem PBS bringen. Zentrifugieren Sie bei 250 x g für 5 min bei RT.
- Das PBS aspirieren und noch einmal 1 min bei 250 x g zentrifugieren. Entfernen Sie alle PBS-Reste mit einer p200-Mikropipette aus dem Zellpellet.
>4. Nukleofektion von Caspase-BiFC-Komponenten in humane Monozyten-abgeleitete Makrophagen
HINWEIS: Dieser Abschnitt des Protokolls wird mit dem Neon Transfection System (Table of Materials) durchgeführt. Dieses Protokoll beschreibt die Schritte zur Transfizierung von 1-2 x 105 Zellen mit einer 10 μl Neonspitze (Materialtabelle). Wenn Sie eine 100-μl-Neonspitze verwenden, skalieren Sie entsprechend hoch. Vermeiden Sie es, die Zellen länger als 15 Minuten dem Resuspensionspuffer R auszusetzen, da dies die Lebensfähigkeit der Zellen und die Transfektionseffizienz verringern kann.
- Verdünnen Sie das Reporterplasmid (d. h. mCherry oder dsRedmito bei 100 ng/μL) in nukleasefreiem Wasser oder 0,5x TE-Puffer, um die transfizierten Zellen sichtbar zu machen.
- Verdünnen Sie die Caspase-BiFC-Plasmide auf eine geeignete Konzentration in nukleasefreiem Wasser oder 0,5x TE-Puffer, so dass das Gesamtvolumen der Plasmide 30 % des gesamten Transfektionsvolumens von 10 μl (d. h. 300 ng/μl C1 Pro-VC und 300 ng/μl C1 Pro-VN) nicht überschreitet.
- Bereiten Sie ein steriles 1,5-ml-Mikroröhrchen pro beabsichtigter Transfektion vor und fügen Sie die entsprechende Menge an Reporterplasmid (d. h. 50 ng oder 0,5 μl) und Caspase-BiFC-Plasmide (d. h. 300 ng oder 1 μl C1 Pro-VC und 300 ng oder 1 μl C1 Pro-VN-Fragment) hinzu. Bewahren Sie die Mikroröhrchen immer in der Haube auf.
- Legen Sie die Pipettenstation, das Gerät, die Spitzen, die Elektroporationsschläuche und die Pipette in eine sterile Laminar-Flow-Haube.
Anmerkung: Die Pipettenstation, das Gerät, die Spitzen, die Elektroporationsröhrchen und die Pipette sind im Neon Transfection System enthalten.
- Verbinden Sie den Hochspannungs- und Sensorstecker an der Pipettierstation gemäß den Anweisungen des Herstellers mit den hinteren Anschlüssen des Geräts. Halten Sie die Pipettenstation in der Nähe des Geräts.
- Schließen Sie das Netzkabel an den hinteren Netzanschluss an und schließen Sie das Gerät an die Steckdose an. Drücken Sie den Netzschalter, um das Gerät einzuschalten.
- Geben Sie die Transfektionsparameter im Startbildschirm ein, der angezeigt wird, wenn das Gerät eingeschaltet und ordnungsgemäß angeschlossen ist. Drücken Sie auf Voltage, geben Sie 1000 ein und drücken Sie Done, um die Spannung auf 1000 V einzustellen. Drücken Sie auf Width, geben Sie 40 ein und drücken Sie auf Done, um die Impulsdauer auf 40 ms einzustellen. Drücken Sie abschließend auf # Impulse, geben Sie 2 ein und drücken Sie auf Fertig, um die Anzahl der elektrischen Impulse auf 2 einzustellen.
- Nehmen Sie eines der Elektroporationsröhrchen (im Kit enthalten) und füllen Sie es mit 3 mL Elektrolytpuffer E (für 10 μL-Spitzen und im Kit enthalten) bei RT. Führen Sie das Elektroporationsröhrchen in den Pipettenhalter an der Pipettenstation ein. Stellen Sie sicher, dass die Elektrode an der Seite des Schlauchs nach innen zeigt und dass beim Einführen des Schlauchs ein Klickgeräusch zu hören ist.
- Nehmen Sie das Zellpellet aus Schritt 3.8 und fügen Sie 10 μl vorgewärmten Resuspensions-R-Puffer (im Kit enthalten) für jeweils 1-2 x 105 Zellen hinzu. Vorsichtig mit einer p20-Mikropipette mischen. Geben Sie 10 μl der Zellsuspension in jedes in Schritt 4.3 eingerichtete Röhrchen und mischen Sie es vorsichtig mit einer p20-Mikropipette.
- Nehmen Sie die Pipette und führen Sie eine Spitze ein, indem Sie den Druckknopf am zweiten Stopp drücken. Stellen Sie sicher, dass die Klemme den Befestigungsschaft des Kolbens in der Spitze vollständig aufnimmt und dass kein Spalt im oberen Kopf der Pipette zu sehen ist.
- Um die Probe zu aspirieren, drücken Sie den Druckknopf an der Pipette bis zum ersten Anschlag und tauchen Sie sie in das erste Röhrchen mit dem Zell-Plasmid-DNA-Gemisch. Die Mischung langsam in die Pipettenspitze aspirieren.
Anmerkung: Vermeiden Sie Luftblasen, da sie während der Elektroporation Lichtbögen verursachen und bei Erkennung durch das Gerät die Abgabe des elektrischen Impulses verhindern können. Wenn Luftblasen beobachtet werden, lassen Sie den Inhalt in das Röhrchen ab und versuchen Sie erneut zu aspirieren.
- Führen Sie die Pipette mit der Probe sehr vorsichtig in den Pipettenhalter ein. Vergewissern Sie sich, dass die Pipette einrastet und richtig platziert ist.
- Drücken Sie auf dem Touchscreen auf Start und warten Sie, bis die elektrischen Impulse abgegeben werden. Eine Meldung auf dem Bildschirm zeigt den Abschluss an.
- Nehmen Sie die Pipette langsam aus der Station und geben Sie die transfizierte Zellsuspension sofort in die entsprechende Vertiefung mit vorgewärmtem antibiotikafreiem Medium aus Schritt 2.4, indem Sie den Druckknopf langsam bis zum ersten Anschlag drücken.
Anmerkung: Diese Spitze kann bis zu dreimal für dasselbe Plasmid wiederverwendet werden. Andernfalls entsorgen Sie es in einem Behälter für biologisch gefährliche Abfälle, indem Sie die Drucktaste bis zum zweiten Stopp drücken.
- Die Schritte 4.10 bis 4.14 sind für jedes Röhrchen zu wiederholen, das ein Zell-Plasmid-DNA-Gemisch enthält.
- Die Platte mit den transfizierten Zellen vorsichtig schütteln und 1-3 h in einem befeuchteten Gewebekultur-Inkubator (37 °C, 5 % CO2) inkubieren.
- In jede Vertiefung werden 200 μl vorgewärmtes Nährmedium (vollständiges Medium) aus Schritt 1.1.2 gegeben. Stellen Sie die Schale wieder in den befeuchteten Gewebekultur-Inkubator (37 °C, 5 % CO2). Planen Sie mindestens 24 Stunden für die Genexpression ein.
- Am nächsten Tag untersuchen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen und die Transfektionseffizienz mit einem Epifluoreszenzmikroskop.
- Schalten Sie das Epifluoreszenzmikroskop und die Leuchtstoffröhrenbox gemäß den Anweisungen des Herstellers ein und stellen Sie die Kulturschale auf den Mikroskoptisch.
- Wählen Sie das 10x- oder 20x-Objektiv und den 568-nm-Filter (RFP).
- Um die Lebensfähigkeit der Zellen zu schätzen, drücken Sie die Durchlicht-LED (TL), um alle Zellen im ausgewählten Feld zu visualisieren. Während Sie in das Mikroskop-Okular schauen, drehen Sie den Fokusknopf, bis die Zellen beobachtet werden, und prüfen Sie, ob sich die Zellen im ausgewählten Feld anheften.
Anmerkung: Vollständig angehängte Zellen stellen die lebensfähigen Zellen dar, während schwimmende Zellen nicht lebensfähige Zellen darstellen. Wenn die Konfluenz der Vertiefung hoch ist, könnte das Vorhandensein von nicht gebundenen Zellen das Ergebnis einer Überschätzung der Zellzahl und nicht das Ergebnis einer geringen Lebensfähigkeit sein. Eine geringe Konfluenz, begleitet von einem hohen Gehalt an schwimmenden Zellen, bedeutet jedoch eine geringe Lebensfähigkeit, die sich aus Lichtbögen während der Elektroporation, Plasmidtoxizität oder einer übermäßigen Exposition gegenüber Resuspensions-R-Puffer ergeben kann. Verwenden Sie keine Wells, die das letztere Verhalten aufweisen.
- Um die Transfektionseffizienz abzuschätzen, konzentrieren Sie sich auf Zellen im ausgewählten Feld unter Durchlicht, wie oben beschrieben. Zählen Sie die Gesamtzahl der Zellen im ausgewählten Feld. Wenn die Durchlicht-LED (TL) ausgeschaltet ist, drücken Sie zum Einschalten die Taste für die Auflicht-LED (RL).
- Fokussieren Sie sich auf die Fluoreszenz des Reportergens (rote Blutkörperchen) und zählen Sie die Gesamtzahl der rot fluoreszierenden Zellen. Wiederholen Sie diese Schritte (4.18.4-4.18.5) für mindestens zwei weitere Felder pro Well.
>5. Behandlung von transfiziertem MDM und Caspase BiFC-Datenerfassung
HINWEIS: Wenn Sie planen, die Zellen mit einem Epifluoreszenz- oder Konfokalmikroskop abzubilden, wird eine Behandlung mit qVD-OPh (20 μM) für 1 h vor der Behandlung mit dem gewählten Stimulus empfohlen, um den Caspase-abhängigen Zelltod (überwiegend Apoptose) zu verhindern. Dies wird in der Bildgebung verwendet, um zu verhindern, dass Zellen aufgrund von Apoptose abheben, was es sehr schwierig macht, sie abzubilden, wenn sie sich aus der Brennebene bewegen. Beachten Sie, dass die Caspase-Rekrutierung an die Aktivierungsplattform und das zugehörige Caspase-BiFC nicht von der katalytischen Aktivität der Caspase abhängt und die Caspase-Hemmung diesen Schritt folglich nicht beeinflusst.
- Etwa 24 Stunden nach der Transfektion mit dem gewählten Stimulus behandeln und so lange inkubieren, wie es für jedes Medikament erforderlich ist.
- Bereiten Sie das Bildgebungsmedium vor, indem Sie das Kulturmedium aus Schritt 1.1.2 mit Hepes (20 mM, pH 7,2-7,5) und 2-Mercaptoethanol (55 μM) ergänzen.
- Geben Sie die gewünschte Reizkonzentration in das vorgewärmte Bildmedium und mischen Sie es vorsichtig.
- Entfernen Sie das Medium vorsichtig mit einer p1000-Mikropipette aus den Zellen und fügen Sie 500 μl der Stimuluslösung aus Schritt 5.1.2 an der Seite der Vertiefung hinzu.
- Um unbehandelte Kontrollwells zu betreiben, fügen Sie ein Bildgebungsmedium ohne den Stimulus hinzu.
- Inkubieren Sie die Zellen in einem befeuchteten Gewebekultur-Inkubator (37 °C, 5 % CO2) so lange, wie es für jede Behandlung angezeigt ist.
- Visualisieren Sie die Zellen mit einem Epifluoreszenz- oder Konfokalmikroskop.
- Schalten Sie das Mikroskop und die Leuchtstoffröhre gemäß den Anweisungen des Herstellers ein.
- Wählen Sie das 10x oder 20x Objektiv und stellen Sie die Kulturschale auf den Mikroskoptisch.
- Finden Sie mit dem Mikroskop-Okular Zellen unter dem 568-nm-Filter und fokussieren Sie sich auf die Zellen, die den dsRedmito/mCherry-Reporter exprimieren (rote Blutkörperchen).
- Zählen Sie alle roten Blutkörperchen im Gesichtsfeld und notieren Sie die Anzahl.
- Wechseln Sie im selben Gesichtsfeld zu den Filtern 488 oder 512 (GFP oder YFP), zählen Sie die Anzahl der roten Blutkörperchen, die ebenfalls grün sind (Venus-positiv oder BiFC-positiv), und notieren Sie die Anzahl.
- Zählen Sie mindestens 100 dsRedmito/mCherry-positive Zellen aus mindestens drei einzelnen Gesichtsfeldern.
