Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Vorbereitung des Experiments
- Herstellung des Darmorgankulturgeräts (3 Tage)
- Drucken Sie mit einem 3D-Drucker die wiederverwendbaren Kunststoffformen für das Organkulturgerät (das Gerät hat 6 Vertiefungen mit 24 kleinen und großen Löchern und für den Gerätedeckel).
HINWEIS: Diese Kunststoffformen können für die Herstellung zahlreicher Geräte verwendet werden.
- Führen Sie die stumpfen Nadeln (22 G und 18 G) an die entsprechende Position in der Geräteform ein und gießen Sie ca. 20 g Polydimethylsiloxan (PDMS)-Mischung (1:10 Gewichtsverhältnis, Basis zu Katalysator) für einen Satz des Geräts und des Deckels.
- Stellen Sie die Formen für 30 Minuten in eine Vakuumkammer, um Luftblasen aus der PDMS-Mischung zu entfernen.
- Inkubieren Sie die Formen über Nacht bei 55 °C, um die PDMS-Polymerisation abzuschließen.
- Wenn das PDMS eingestellt ist, ziehen Sie die Nadeln aus der Form heraus und lösen Sie vorsichtig das Kulturgerät und den Deckel von den Kunststoffformen.
- Entfernen Sie PDMS-Rückstände mit einer chirurgischen Klinge aus dem Well-Umriss. Befestigen Sie das PDMS-Gerät und die Geräteabdeckung mit ungiftigem Silikonkleber auf einem Deckglas (75 mm x 50 mm Mikrodias) und lassen Sie die Teile über Nacht fest werden (tragen Sie den Kleber auf die glatte Seite des Geräts auf).
- Führen Sie zwölf 22 G Nadeln für das Lumen und zwölf 18 G Nadeln für die Vertiefung ein. Fixieren Sie alle Nadeln mit Silikon und lassen Sie es über Nacht einwirken. Führen Sie zwei 18-G-Nadeln in den Abdeckdeckel ein, um einen ordnungsgemäßen Luftstrom in und aus dem Darmorgankulturgerät zu gewährleisten.
- Überprüfen Sie alle Nadeln mit einer mit Wasser gefüllten Spritze auf Undichtigkeiten. Vergewissern Sie sich, dass keine Lecks aus den Brunnen kommen, indem Sie die Brunnen mit Wasser füllen.
- Platzieren Sie zwei chirurgische Knoten auf jeder 22 G-Nadel, die mit dem Dickdarm verbunden wird. Legen Sie das Gerät und den Deckel in eine Papiertüte im Autoklaven und sterilisieren Sie es in einem Autoklaven.
- Nährmedium (0,5 h)
- Mischen Sie in einer biologischen Haube Folgendes (in einer 50-ml-Tube): 37 ml Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM), 10 mL KSR-Serumersatz, 1 mL B27-Supplement, 0,5 mL N2-Supplement, 0,5 mL 1 M HEPES-Puffer und 0,5 mL nicht-essentielle Aminosäuren.
- Das gesamte Medium filtrieren und bei 4 °C lagern.
- Vorbereitung von Schläuchen und chirurgischen Instrumenten
- Schneiden Sie die Röhren für das Eingangslumen, das Eingangs-Well, das Ausgangs-Lumen und das Ausgangs-Well (12 kurze Röhren und 12 lange Röhren) entsprechend ab. Schließen Sie an jeder Seite des Rohrs einen entsprechenden Adapter an.
- Bereiten Sie die chirurgischen Instrumente vor: gerade Schere, 4x dünne Pinzette und 2x scharfe Pinzette.
- Legen Sie die Schläuche und die chirurgischen Instrumente in eine Papiertüte im Autoklaven und sterilisieren Sie sie mit einem Autoklaven.
- Bereiten Sie den luminalen Input vor (gewünschte Stimulation - Bakterien, Stuhl, Medikamente, etc.).
- Vor dem Experiment ist die bakterielle Belastung der Bakterienkultur durch serielle Verdünnungen und Kultivierung unter aeroben und/oder anaeroben Bedingungen zu bestimmen.
- Nach der Berechnung der Bakterienlast verdünnen Sie die Bakterienkulturen in einem sterilen Gewebekulturmedium, um die erforderliche Bakterienkonzentration zu erhalten. Bei Stuhlproben mit einem 100-μm-Sieb filtrieren.
Anmerkung: Für eine nicht-bakterielle Stimulation (Medikamente, Metaboliten usw.) verdünnen Sie die Substanz mit dem Darmkulturmedium auf die erforderliche Konzentration.
>2. Vorbereitung des Experimentaufbaus
- Schalten Sie im Inneren des Organkultur-Inkubators die Heizeinheit ein und stellen Sie sie auf 37 °C ein.
- Richten Sie die Pumpen sowie die Ein- und Ausgangsspritzen
ein.
- Eingabe von Gewebekulturmedien
- Füllen Sie in einer biologischen oder Laminar-Flow-Haube die Input-Well-Spritzen mit einem vollständigen Nährmedium. Das endgültige Volumen hängt von der Dauer des Experiments und der Flussrate ab. in der Regel 1 mL/h plus ein zusätzliches Medium für die Spülung.
- Verbinden Sie die Schläuche mit dem Luer-Lock-Adapter mit den Spritzen. Legen Sie die gefüllten Spritzen in die Spritzenpumpen.
- Spülen Sie die Eingangsspritzen. Achten Sie darauf, dass das Well-Medium aus allen Rohren in ein Altglas fließt.
- Luminal-Eingang
- Füllen Sie die Luminal-Eingangsspritzen mit einer Stimulationsbehandlung (Bakterien, Medikamente usw.). Das Volumen hängt von der Dauer des Experiments und der Durchflussrate ab (in der Regel 30 μL/h plus ein zusätzliches Medium für die Spülung).
- Verbinden Sie die Schläuche mit dem Luer-Lock-Adapter mit den Spritzen. Legen Sie die gefüllten Spritzen in die Spritzenpumpen.
- Spülen Sie die Eingangsspritzen. Achten Sie darauf, dass die Stimulation aus allen Röhren in ein Altglas fließt. Achten Sie darauf, die verschiedenen Stimulationen nicht zu verunreinigen.
- Ausgaben
- Legen Sie die leeren Spritzen in die Ausgangsspritzenpumpen (stellen Sie den Pumpenmodus auf "Entnahme").
- Einrichtung des Geräts
- Stellen Sie den Regler ein, der die Durchflussrate des Gasgemisches (95 % O2 + 5 % CO2) für einen sanften, minimalen Durchfluss steuert.
- Untersuchen Sie das Gerät in einer laminaren Haube.
- Spülen Sie die Nadeln des Geräts mit sterilem IMDM, um die Nadeln zu waschen.
- Geben Sie 500 μl steriles Kulturmedium in jede Vertiefung des Geräts.
- Vorbereitung für die Gewebedissektion
- Legen Sie die sterilen chirurgischen Instrumente in die Laminarhaube.
- Füllen Sie eine 10-ml-Spritze mit sterilem IMDM und schließen Sie eine sterile (autoklavierte) 22-G-Nadel mit stumpfem Ende zur Spülung des Dickdarms an.
>3. Organkulturen
- Mäusetötung und Gewebedissektion
- Opfern Sie in einer laminaren Haube 12 bis 14 Tage alte Mäuse durch Enthauptung. Besprühen Sie die Mäuse mit 70% Ethanol und legen Sie die Mäuse auf eine Plastikplatte.
- Sezieren Sie die Maus mit einer scharfen Schere und Pinzette und entfernen Sie den Verdauungstrakt vom Magen bis zum Anus, indem Sie das gesamte Fett und Bindegewebe durchtrennen. Schneiden Sie den Doppelpunkt ab und legen Sie ihn auf eine neue Platte.
Anmerkung: Minimieren Sie den Kontakt mit dem Dickdarmgewebe. Berühren Sie nicht den mittleren Teil des Dickdarmgewebes. Halten Sie das Taschentuch sanft und nur an den Rändern des Gewebes.
- Dickdarmspülung und -wäsche
- Unter einem Dissektionsmikroskop wird der Dickdarminhalt mit sterilem IMDM mit der vorbereiteten 10-mL-Spritze vorsichtig (in die proximale Seite) gespült (Schritt 2.7.2). Nachdem Sie den Kot aus dem Darmgewebe entfernt haben, legen Sie den Dickdarm in eine neue 6-Well-Platte, die mit 0,5 ml sterilem IMDM gefüllt ist.
- Verbinden des Doppelpunkts mit dem Gerät
- Nehmen Sie das Taschentuch, verbinden Sie es vorsichtig mit der 22 G Nadel und binden Sie es mit den beiden Fäden fest. An dieser Stelle ist es zwingend erforderlich, die korrekte Ausrichtung des Dickdarms zum Lumenfluss beizubehalten (proximal = Eingang, distal = Ausgang). Wiederholen Sie die Schritte 3.2-3.3 für alle 6 Gewebe
.
- Vergewissern Sie sich, dass die Luer-Locken der Eingabenadel vom Medium leer sind. Wenn nicht, leeren Sie sie. Fügen Sie der Luer-Lock-Funktion der Eingangsnadel Stimulationen hinzu (um das Eindringen von Luftblasen in das Lumen zu verhindern). Wiederholen Sie diesen Schritt für jeden Dickdarm mit der entsprechenden Stimulation.
- Überprüfen Sie, ob alle Taschentücher angeschlossen sind, und setzen Sie den Abdeckdeckel auf das Gerät.
- Anschließen des Organkulturgeräts an die Pumpen
- Stellen Sie das Gerät in die vorgeheizte Temperaturkammer (37 °C).
- Gasfluss anschließen
- Verbinden Sie das Gasadapter mit der entsprechenden Eingabenadel mit dem Deckel.
- Verbinden Sie die Ein- und Ausgangsröhren mit dem Gerät.
Anmerkung: Verbinden Sie die proximale Dickdarmseite mit den Eingangswannen.
- Spülen Sie das Lumen mit den Stimulationseingängen.
- Lassen Sie die luminale Stimulation sanft durch den Darm fließen und überprüfen Sie den Medienfluss in den Ausgangsröhren.
- Externes Medium waschen.
- Waschen Sie das externe Medium 3 Mal (stellen Sie die Pumpen auf eine Geschwindigkeit von 600 μL/min für den Ein- und Ausgang ein). Jede Wäsche dauert 1 Minute (beginnend mit dem Entleeren der Vertiefung).
- Starten Sie das Experiment.
- Starten Sie die Pumpen mit den folgenden Geschwindigkeiten:
Durchflussmenge: Lumen: Eingang - 30 μL/h, Ausgang - 35 μL/h
Externes Medium: Eingang - 1000 μL/h, Ausgang - 950 μL/h
Anmerkung: Die Experimentierzeit kann zwischen 30 Minuten und 24 Stunden variieren.
- Ende des Versuchs (bis zu 24 h für Darmorgankulturen)
- Trennen Sie alle Schläuche vom Gerät.
- Trennen Sie das Taschentuch von den Nadeln und fahren Sie mit den gewünschten Messwerten fort.
