Alle Eingriffe mit menschlichen Teilnehmern wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für das Wohlergehen des Menschen durchgeführt und vom lokalen institutionellen Prüfungsausschuss überprüft.
>1. WS-CM Vorbereitung
- Erzeugen Sie das gesamte rauchkonditionierte Medium (WS-CM) wie zuvor beschrieben.
- Bereiten Sie WS-CM vor, indem Sie den Rauch von vier 3R4F-Referenzzigaretten durch das Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium ohne Phenolrot leiten, wobei Sie das folgende Rauchschema anwenden: 35-60-2, Zugvolumen in ml, Zugintervall in Sekunden bzw. Zugdauer in Sekunden. Jedes Präparat erzeugt eine 20-ml-Probe.
- Beschriften Sie die Tube(s) mit Datum, Uhrzeit sowie Name und Nummer der Zigarette. Lagern Sie die 500 μl Aliquots unmittelbar nach Beendigung des Räucherns bei -80 °C.
- Analysieren Sie Aliquots von gefrorenem WS-CM, um den Gehalt an Nikotin, tabakspezifischen Nitrosaminen und polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen zu bestimmen, wie zuvor beschrieben.
>2. Isolierung von mononukleären Zellen des peripheren Blutes, PBMCs
- Entnahme von frischem Blut von gesunden Spendern (die keine Tabakprodukte konsumieren) Isolierung von PBMCs aus frischem Blut wie unten beschrieben.
- Halten Sie vor dem Eintreffen des Blutbeutels eine 500-ml-Flasche, eine Schere, einen Isolationspuffer und die phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS) (RT) von Dulbecco in einer Zellkulturhaube der Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2) bereit. Der Isolationspuffer muss vor Licht geschützt werden.
- Halten Sie den Blutbeutel auf den Kopf und schneiden Sie den Schlauch direkt unter der Stelle, an der er festgeklemmt wurde, so dass mindestens 3 cm Schlauch übrig bleiben.
- Entfernen Sie den Verschluss von der 500-ml-Flasche und halten Sie das Röhrchen über die Flaschenöffnung. Nehmen Sie den Blutbeutel auf und drehen Sie ihn um, damit das Blut ungehindert aus dem Beutel in die Flasche fließen kann, bis der Beutel leer ist. Lassen Sie das Blut an die Innenwand der Flasche fließen und nicht direkt nach unten, um Blasenbildung zu vermeiden.
- Gießen Sie Isolationspuffer in einem Verhältnis von 1:5 von Isolationspuffer zu Blut in die Flasche. Verschließen Sie die Flasche fest und drehen Sie sie vorsichtig 10 Mal um. Lassen Sie die Flasche in der Zellkulturhaube bei ausgeschaltetem Licht 1 Stunde lang bei RT inkubieren.
- Über dem Blut bildet sich eine helle, strohfarbene Schicht. Entfernen Sie diese Schicht mit einer serologischen 25-ml-Pipette in konische 50-ml-Röhrchen. Die gesammelte Menge kann zwischen 50 und 300 ml variieren, abhängig von der Person, die Blut gespendet hat.
- Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 200 x g für 10 min bei RT.
- Aspiriere den durchscheinenden Überstand und lasse das dunkle blutfarbene Kügelchen zurück. Das Pellet ist locker, aber zähflüssig.
- 3 ml Isolationspuffer in konische 15-ml-Röhrchen pipettieren.
- Dem resuspendierten Pellet werden je 50 ml strohfarbene Flüssigkeit, die in Schritt 2.1.5 gesammelt wurde, 20 ml DPBS zugesetzt. Vortex, um die resuspendierte Flüssigkeit aus mehreren Röhrchen gründlich zu mischen und zu konsolidieren. Diese Flüssigkeit enthält suspendierte Blutzellen.
- Mit einer Transferpipette werden in Schritt 2.1.8 5 ml der suspendierten Blutzellen auf 3 ml Isolationspuffer überführt. Kippen Sie das konische 15-ml-Röhrchen, das die Zellsuspension enthält, langsam und sanft, um zwei separate Schichten zu bilden. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 400 x g für 40 min bei RT mit minimaler Beschleunigung und ohne Bremse.
- Verwenden Sie eine Transferpipette, um die resultierende trübe mittlere Schicht (Buffy Coat), die PBMCs enthält, in ein konisches 50-ml-Röhrchen zu entfernen. Vermeiden Sie es, andere durchsichtige Ebenen darunter zu zeichnen. Füllen Sie nicht mehr als 25 ml in jedes konische 50-ml-Röhrchen.
- Fügen Sie 25 ml kaltfließenden Puffer hinzu (oder mehr, um das gesamte verbleibende Volumen des konischen 50-ml-Röhrchens zu füllen), um die Zellen zu waschen. Die Zellen bei 400 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugieren.
- Resuspendieren Sie das Pellet mit 10 ml Laufpuffer. Diese enthält PBMCs. Zählen Sie die Zellen und verwenden Sie sie sofort oder legen Sie sie zum Einfrieren auf Eis.
>3. Einfrieren und Auftauen der PBMCs
- Die in Schritt 2.1.13 entnommenen mononukleären Blutzellen (PBMCs) werden 10 min lang bei 400 x g zentrifugiert.
- Füllen Sie den Gefrierbehälter mit Isopropylalkohol gemäß den Anweisungen des Herstellers.
Vorsicht: Isopropylalkohol ist brennbar und akut giftig.
- Resuspendieren Sie das Pellet mit RPMI 1640 Medium (4 °C), das 20 % fötales Rinderserum (FBS) und 10 % Dimethylsulfoxid (DMSO) enthält. Dies ist RPMI 1640 Gefriermedium. Resuspendieren Sie das Pellet mit einer Menge Gefriermedium, die zu einer Suspension mit etwa 5 x 107 Zellen/ml führt. Die Anzahl der Zellen, die zum Einfrieren zur Verfügung stehen, variiert.
- Geben Sie 1 ml Aliquots der Zellsuspension in 2 ml Kryoröhrchen und legen Sie die Kryoröhrchen in den Gefrierbehälter. Stellen Sie den Gefrierbehälter mit Kryoröhrchen in einen Gefrierschrank bei -80 °C, um O/N zu lagern, und entfernen Sie dann die Kryoröhrchen und lagern Sie ihn in einem Kryogefrierschrank zwischen -150 °C und -190 °C.
- Nehmen Sie das Kryoröhrchen aus der Kryolagerung und tauen Sie es unter leichtem Rühren in einem Wasserbad bei 37 °C schnell auf.
- Übertragen Sie die aufgetauten PBMCs sofort im Kryoröhrchen in ein konisches 15-ml-Röhrchen mit 10 ml RPMI 1640 Vollmedium (4 °C), das 10 % FBS, 1 % Pen/Strep und 1 % L-Glutamin enthält. Der Inhalt des aufgetauten Kryoröhrchens sollte so schnell wie möglich übertragen werden, um eine maximale Lebensfähigkeit der Zellen zu erreichen.
- Zentrifugieren Sie die PBMCs bei 400 x g für 10 min.
- Resuspendieren Sie das Pellet mit 5 ml RPMI 1640 Vollmedium und zählen Sie die Zellen.
- Messen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen mit etablierten Methoden wie der Trypanblau-Ausschlussmethode. Im Allgemeinen liegt die Zellviabilität bei dieser Methode bei etwa 90 - 95%. Die PBMCs sind nun bereit für den Einsatz in Experimenten.
>4. Intrazelluläre Färbung und Durchflusszytometrie
HINWEIS: Die hier aufgeführten Verdünnungen dienen dem Zweck dieser Studie. Die Verdünnungen können entsprechend angepasst werden.
- Verdünnen Sie WS-CM in einer 96-Well-Platte mit RPMI-Vollmedium auf ein Gesamtvolumen von 100 μl/Well bei einer Konzentration von 0,3, 1,56, 3 und 5 μg/ml Äquinitineinheiten.
- Verdünnen Sie Nikotin in derselben Platte auf die folgenden Konzentrationen: 2, 10, 50, 100, 500, 2000 und 4000 μg/ml.
Vorsicht: Nikotin ist akut giftig und umweltgefährdend.
- 100 μl PBMCs, die in RPMI-Vollmedium suspendiert sind, werden in einer Konzentration von 1 × 106 Zellen/Vertiefung zugegeben. Das Gesamtvolumen der Zellen plus WS-CM oder Nikotin beträgt 200 μl/Well.
- Die Platte zugedeckt 3 Stunden bei 37 °C und 5 % CO2 inkubieren.
- Waschen Sie die Zellen bei RT, indem Sie 3 Minuten lang bei 300 × g zentrifugieren, den Überstand ansaugen, den Boden der Platte mit abgedeckter Platte vortexen und schließlich die Zellen mit 200 μl eiskalt laufendem Puffer resuspendieren und den Waschschritt noch einmal wiederholen.
- Geben Sie 200 μl RPMI-Vollmedium auf die Platte und wiederholen Sie den Waschschritt noch einmal.
- Bereiten Sie die Arbeitskonzentrationen von 2 μl/ml GolgiPlug und 10 μg/ml LPS mit RPMI-Vollmedium vor und geben Sie 200 μl in jede Vertiefung.
- Die Platte wird 6 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert.
- Am Ende von Schritt 9.8 die Zellen mit laufendem Puffer (4 °C) waschen und bei 300 x g für 3 min bei 4 °C schleudern.
- 100 μl Cytofix in jede Vertiefung geben und 20 Minuten bei 4 °C inkubieren.
- Waschen Sie die Zellen 3 Mal wie in Schritt 9.9 beschrieben mit 1x Permwash (4 °C) bei 300 x g für 3 min bei 4 °C.
- Geben Sie 45 μl 1x Cytoperm in jede Vertiefung, gefolgt von je 5 μl eines der folgenden Antikörper in jede Vertiefung: TNF-α-Alexa Fluor 488, IFN-γ V500, MIP-1α PE. 30 min bei 4 °C inkubieren.
- Waschen Sie die Zellen zweimal, wie in Schritt 9.9 beschrieben, mit 1x Permwash (4 °C) und einmal mit Laufpuffer (4 °C) bei 300 x g für 3 min bei 4 °C.
- Resuspendieren Sie die Zellen mit 200 μl 2% Paraformaldehyd (4 °C). Übertragen Sie die Zellen in 12 × 75 mm Röhrchen und analysieren Sie die Proben auf einem Durchflusszytometer.
Vorsicht: Paraformaldehyd ist ätzend, akut giftig und gesundheitsgefährdend.
