In vitro Biofilmsynthese durch Staphylococcus aureus

>1. Herstellung von in vitro Biofilm

1. Gewinnen Sie isolierte Kolonien von S. aureus aus einem kryokonservierten Bestand mit einer Streifenplattentechnik auf einer nährstoffreichen Agarplatte, wie z. B. Tryptischem Soja-Agar (siehe Materialtabelle).
2. Beschichten Sie einzelne Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit 100 μl 0,001 % (v/v) Poly-L-Lysin (PLL), verdünnt in sterilem H₂O, und inkubieren Sie es 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Aseptisch aspirieren Sie die PLL-Lösung mit einer vakuumunterstützten Aspirationsfalle. Lassen Sie die Vertiefungen über Nacht bei Raumtemperatur trocknen.
   Anmerkung: Alle Aspirationsschritte im Protokoll werden, sofern nicht anders angegeben, mit einer vakuumunterstützten Aspirationsfalle durchgeführt.
3. Bereiten Sie eine Übernachtkultur vor, indem Sie eine Kolonie von S. aureus in minimal essentiellen Medien alpha (MEMα) inokulieren, die mit 2 % Glukose ergänzt werden, und bei 37 °C inkubieren und 16-18 Stunden lang bei 200 U/min schütteln.
4. Verdünnen Sie die Übernachtkultur, indem Sie 50 μl auf 5 ml frisches MEMα, ergänzt mit 2 % Glukose, übertragen und bei 37 °C unter Schütteln bei 200 U/min bis zur mittleren logarithmischen Phase inkubieren, im Allgemeinen zwischen einer optischen Dichte von 600 (OD_{600 nm}) von 0,5 bis 0,8. Verwenden Sie MEMα, um die mittlere logarithmische Kultur auf einen OD_{von 600 nm} von 0,1 zu normalisieren.
5. Übertragen Sie 150 μl normalisierte Kultur in jede Vertiefung der PLL-behandelten 96-Well-Platte. 18-20 h statisch in einer befeuchteten Kammer bei 37 °C inkubieren.
   Anmerkung: Die Biofilme können auch in anderen Formaten wie z.B. μ-Kanal-Objektträgern gezüchtet werden (siehe Materialtabelle).
6. Aspirieren Sie den Überstand, um die planktonischen Zellen zu entfernen. Waschen Sie die restliche Biomasse vorsichtig mit 150 μl der Balanced Salt Solution (HBSS) von Hanks, um die nicht gebundenen Zellen zu entfernen. Fügen Sie HBSS tropfenweise hinzu, um eine Störung des Biofilms zu vermeiden.
   Anmerkung: Beim Ansaugen des Überstands und des HBSS während des Waschens gerade so viel Flüssigkeit (Überstand oder HBSS) in den Vertiefungen mit dem Biofilm belassen, dass der Biofilm noch eingetaucht ist. Dies verhindert die Störung der Biofilmstruktur, wenn HBSS tropfenweise zugegeben wird, um den Biofilm zu waschen.
7. Wiederholen Sie Schritt 1.6 mindestens zwei weitere Male, um alle Planktonzellen zu entfernen. Zu diesem Zeitpunkt sind die Biofilme bereit für unmittelbare nachgelagerte Experimente.
   Anmerkung: Wenn die Biofilme nicht für Neutrophilenexperimente verwendet werden, kann HBSS durch phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) substituiert werden. HBSS wird PBS vorgezogen, da HBSS Komponenten enthält, einschließlich Glukose, die optimale Bedingungen für die Aktivierung von Neutrophilen bieten.