Eine In-vitro-Technik zur Stimulation von Lymphozyten über pathogene Bakterien

Zusammenfassung

Quelle: Dousha, L., et al. Bewertung der Immunantwort der Atemwege auf Haemophilus influenzae. J. Vis. Exp. (2021)

Dieses Video zeigt eine in vitro Technik zur Stimulation von Lymphozyten über nicht-typisierbare Haemophilus influenzae (NTHi) und zur Beurteilung der Immunantwort. Die Inkubation isolierter mononukleärer Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) mit NTHi bewirkt, dass die Bakterienzellen T-Lymphozyten stimulieren, was zur Zytokinproduktion führt. Nach Hemmung der Sekretion von Zytokinen wird eine Immunfluoreszenzfärbung durchgeführt, um die akkumulierten intrazellulären Zytokine in stimulierten T-Lymphozyten nachzuweisen.

Protokoll

>1. Antigene Zubereitung

HINWEIS: Drei verschiedene antigene Präparate können verwendet werden, um die Immunantwort auf Hi zu beurteilen. Diese sind: 1) eine subzelluläre Komponente (typischerweise aus der bakteriellen Zellwand); 2) abgetötete und inaktivierte Bakterien; und 3) lebende Bakterien. Bestimmen Sie die Verwendung jedes antigenen Präparats vor Beginn von Experimenten.

1. Subzelluläre Bestandteile
   1. Beziehen Sie subzelluläre Komponenten aus Quellen, einschließlich kommerzieller Präparate, intern entwickelter Komponenten und/oder von anderen Forschern.
      Anmerkung: Subzelluläre Komponenten, die normalerweise aus der bakteriellen Zellwand stammen, können verwendet werden und umfassen Proteine der äußeren Membran wie P6 und Lipooligosaccharid (LOS). Diese subzellulären Komponenten werden in der Regel in spezialisierten Zentren gewonnen. Die Beschreibung, wie sie hergestellt werden, würde den Rahmen dieses Artikels sprengen. Um diese Komponenten zu erhalten, wird der direkte Kontakt zu Experten auf diesem Gebiet empfohlen.
2. Abgetötete/inaktivierte Bakterien
   1. Gewinnen Sie die Bakterien aus der entsprechenden Probe (z. B. Sputum oder Bronchoskopie). Bestätigen Sie den Stamm mit einem geeigneten mikrobiologischen Labor als H. influenzae. Führen Sie eine Typisierung der H. influenzae-Proben durch, um sicherzustellen, dass sie nicht typisierbar sind (NTHi, durch ein spezialisiertes mikrobiologisches Labor).
   2. Um ein repräsentatives Antigen zu erhalten, verwenden Sie mehrere NTHi-Stämme (mindestens 5, jeder mit ungefähr der gleichen Menge), um ein gepooltes Antigen herzustellen. Lagern Sie die Stämme bei -70 °C in Glycerinbrühe in Mikrozentrifugenröhrchen.
      Anmerkung: In diesem Experiment wurden zehn verschiedene Stämme verwendet.
   3. Tauen Sie die Stämme (jeweils ein Mikrozentrifugenröhrchen) auf Schokoladen-Agar-Platten auf und züchten Sie sie über Nacht in einem 37 °C heißen Inkubator mit 5 % CO₂. Geben Sie die Bakterien in 500 μl phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) und waschen Sie sie zweimal (5 min lang bei 300 x g schleudern). Es wird ein MacFarland-Standard oder ein Spektralphotometer verwendet, um NTHi auf eine Konzentration von 10⁸ ml zu aliquotieren (unter Verwendung eines 5-ml-Behälters oder eines gleichwertigen Behälters).
   4. Hitzeinaktivierung der Bakterien, indem Sie sie 10 Minuten lang in ein Wasserbad bei einer Temperatur von 56 °C legen.
   5. Beschallen Sie die Bakterien mit einer kontinuierlichen Beschallungseinstellung bei niedriger bis mittlerer Geschwindigkeit für 30 Sekunden.
   6. Aliquotieren Sie das entsprechende Probenvolumen in Mikrozentrifugenröhrchen. Für eine Probe von 10⁸ ml werden Aliquots von 50 μl (d. h. 20 Proben pro ml) verwendet und bis zur Anforderung bei -70 °C eingefroren.
3. Lebende Bakterien
   1. Zunächst ist die Charakterisierung lebender Bakterien, wie in Schritt 1.2.1 beschrieben, zu charakterisieren. Verwende einen gut charakterisierten Stamm. Achten Sie darauf, dass der Stamm auch in Glycerinbrühe bei -70 °C als Reserve gelagert wird.
   2. Züchten Sie die Bakterien auf angereicherten Medien wie Schokoladenagarplatten oder in Brühe.
      1. Um Schokoladen-Agar-Platten zu verwenden, verteilen Sie die Bakterien mindestens alle 3-4 Tage mit sterilen Spreadern.
      2. Alternativ können Sie Brain Heart Infusion (BHI)-Brühe verwenden, die mit den Faktoren X (Hemin) und V (β-Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid) angereichert ist, um die Bakterien zu züchten. NTHi von Übernachtplatten in 5-10 ml BHI-Bouillon impfen, die sowohl mit Hämin als auch mit β-Nicotinamid-Adenindinukleotid (beide 10 μg/ml) ergänzt wurde, und über Nacht bei 37 °C in einem 5%igen CO₂ -Inkubator kultivieren.
         Anmerkung: Dies hat den Vorteil der Reproduzierbarkeit, der höheren Anzahl koloniebildender Einheiten (KBE) und der Tatsache, dass sich alle Bakterien in einer ähnlichen Phase des logarithmischen Wachstums befinden (auf Platten kann die Lebensfähigkeit der Bakterien je nach Position in der Kultur größer sein).
   3. Verwenden Sie eine Multiplizität von Infektionen (MOI) von 100 Bakterien in einer Zelle, um eine starke Immunantwort auszulösen und gleichzeitig die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten. Verwenden Sie den MacFarland Standard oder ein Spektralphotometer, um die Anzahl der Bakterien zu bestimmen.
   4. Stellen Sie sicher, dass das für lebende NTHi-Assays verwendete Medium frei von menschlichem Serum ist, da dies die Bakterien abtötet. Tierische Serumproben (z.B. fötales Kälberserum) bereiten in der Regel keine Probleme.
      Anmerkung: Verwenden Sie die unten beschriebenen Methoden, um Standardgewebeproben wie peripheres Blut, Bronchoskopieproben (insbesondere bronchoalveoläre Lavage (BAL)) und reseziertes Lungengewebe zu analysieren. Inkubieren Sie die Proben mit Hi-Antigen von 10 Minuten bis 24 Stunden oder länger.

>2. Beurteilung der Lymphozytenfunktion im peripheren Blut

1. Verwenden Sie Vollblut- oder mononukleäre Zellpräparate für Durchflusszytometrie-Assays.
2. Entnehmen Sie Proben von jedem Probanden durch Venenpunktion. Sammeln Sie 4 ml Blut aus einer peripheren Vene in einem Lithium-Heparin-Röhrchen und teilen Sie die Proben zur Kontrolle und Antigenstimulation in Aliquote auf.
3. Beiden Proben werden kostimulatorische Antikörper (Anti-CD28 und CD49d, 1 μl/ml) zugesetzt. NTHi zur Antigenprobe geben und 1 h bei 37 °C und 5 % CO₂ inkubieren. Für das abgetötete NTHi-Präparat fügen Sie 200 μl des Antigens zu 2 ml Blut hinzu. Für lebende NTHi fügen Sie lebende NTHi-Zellen mit einem MOI von 100:1 zu den weißen Blutkörperchen hinzu (gemessen mit dem Hämozytometer).
4. Geben Sie das Golgi-Blocker Brefeldin A (10 μl/ml) zu den Proben und inkubieren Sie sie für weitere 5 h.
   Anmerkung: Durch die Blockade des Golgi-Apparats wird verhindert, dass die Zytokine aus der Zelle exportiert werden.
5. Wenn Vollblut verwendet wird, lysieren Sie die Erythrozyten mit 0,8 % Ammoniumchlorid, um nur Leukozyten in Lösung zu lassen. Fixieren Sie die Leukozyten mit 500 μl 1%-2% Paraformaldehyd für 1 h.
6. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer, permeabilisieren Sie 10⁶ Zellen 15 Minuten lang mit 100 μl 0,1 % Saponin und inkubieren Sie die Zellen mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern. Waschen Sie die Zellen und analysieren Sie sie mit einem Durchflusszytometer.
   Anmerkung: Die Menge der fluoreszenzmarkierten Antikörper ist spezifisch für jedes Zytokin. Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers. Typischerweise werden 10⁶ Zellen in 100 μl Lösung 1 h lang gefärbt. Die meisten kommerziell erhältlichen Antikörper reichen aus, um 25-100 Tests durchzuführen.
7. Bestimmen Sie den Anteil der Antigen-responsiven Zellen durch Gating der relevanten Lymphozytenpopulation (Zellen werden durch CD45, dann durch CD3 und später durch CD4- oder CD8-Expression angesteuert), wie in Abbildung 1 gezeigt. Führen Sie eine Hintergrundfärbung an nicht stimulierten Zellen für alle zu analysierenden Zytokine durch. Screenen Sie 100.000 Zellen, um jedes Zytokin sowohl auf stimulierte Zellen als auch auf die Kontrolle zu analysieren.

Ergebnisse

Abbildung 1: Zytokinproduktion im Lungengewebe. Die Zellen werden zunächst mittels Durchflusszytometrie auf ihre Expression des Leukozytenmarkers CD45 (A) analysiert. Diese Population wird dann weiter auf CD3-Expression (B) und CD4/CD8-Expression (C) analysiert. CD3/CD4+-Zellen werden in Kontroll- (D) und NTHi-stimulierten Proben ...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Ammoniumchlorid	Sigma Aldrich	Artikel-Nr.: 213330
Brefeldin	Sigma Aldrich	Nr. B6542
CD28	Thermofischer	Artikel-Nr.: 16-0289-81
CD49d	Thermofischer	534048
saponin	Sigma Aldrich	8047152