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Alle Eingriffe mit menschlichen Teilnehmern wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für das Wohlergehen des Menschen durchgeführt und vom lokalen institutionellen Prüfungsausschuss überprüft.
>1. Antigene Zubereitung
- Lebende Bakterien
- Erstens: Charakterisieren Sie lebende Bakterien. Gewinnen Sie die Bakterien aus der entsprechenden Probe (z. B. Sputum oder Bronchoskopie). Bestätigen Sie den Stamm als Haemophilus influenzae in einem geeigneten mikrobiologischen Labor. Führen Sie eine Typisierung der H. influenzae-Proben durch, um sicherzustellen, dass sie nicht typisierbar sind (durch ein spezialisiertes mikrobiologisches Labor). Verwende einen gut charakterisierten Stamm. Achten Sie darauf, dass der Stamm auch in Glycerinbrühe bei -70 °C als Reserve gelagert wird.
- Züchten Sie die Bakterien auf angereicherten Medien wie Schokoladenagarplatten oder in Brühe.
- Um Schokoladen-Agar-Platten zu verwenden, verteilen Sie die Bakterien mindestens alle 3-4 Tage mit sterilen Spreadern.
- Alternativ können Sie Brain Heart Infusion (BHI)-Brühe verwenden, die mit den Faktoren X (Hemin) und V (β-Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid) angereichert ist, um die Bakterien zu züchten. Nicht typisierbares H. influenzae (NTHi) aus Nachtplatten in 5-10 ml BHI-Bouillon impfen, die sowohl mit Hämin- als auch mit β-Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (beide 10 μg/ml) versetzt ist, und über Nacht bei 37 °C in einem 5%igen Kohlendioxid-CO 2-Inkubator kultivieren.
Anmerkung: Dies hat den Vorteil der Reproduzierbarkeit, der höheren Anzahl koloniebildender Einheiten (KBE) und der Tatsache, dass sich alle Bakterien in einer ähnlichen Phase des logarithmischen Wachstums befinden (auf Platten kann die Lebensfähigkeit der Bakterien je nach Position in der Kultur größer sein).
- Verwenden Sie eine Multiplizität von Infektionen (MOI) von 100 Bakterien in einer Zelle, um eine starke Immunantwort auszulösen und gleichzeitig die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten. Verwenden Sie den MacFarland Standard oder ein Spektralphotometer, um die Anzahl der Bakterien zu bestimmen.
- Stellen Sie sicher, dass das für lebende NTHi-Assays verwendete Medium frei von menschlichem Serum ist, da dies die Bakterien abtötet. Tierische Serumproben (z.B. fötales Kälberserum) verursachen in der Regel keine Probleme.
HINWEIS: Verwenden Sie die unten beschriebenen Methoden, um Standardgewebeproben wie peripheres Blut, Bronchoskopieproben (insbesondere bronchoalveoläre Lavage (BAL)) und reseziertes Lungengewebe zu analysieren. Inkubieren Sie die Proben mit Hi-Antigen von 10 Minuten bis 24 Stunden oder länger.
>2. Beurteilung der Lymphozytenfunktion/Entzündungsmediatoren im Lungengewebe
- Es ist in der Regel nicht möglich, genügend Lymphozyten aus der Bronchoskopie zu gewinnen, daher verwenden Sie das Lungengewebe aus Lobektomieproben. Die Optimierung von Lungengewebeproben erfordert eine enge Abstimmung mit dem anatomisch-pathologischen Dienst. Stellen Sie sicher, dass das Gewebe einen Rand von mindestens 3 cm vom Tumor hat und das Zellgewebe ohne signifikantes Emphysem ist (wie vom Pathologen bestimmt).
- Brechen Sie das Lungengewebe in eine zelluläre Suspension, bevor es für Durchflusszytometrie-Assays verwendet werden kann. Verdauen Sie das Lungengewebe chemisch (z.B. mit Kollagenase) oder disaggregieren Sie es mechanisch.
Anmerkung: Die mechanische Disaggregation von Gewebe kann bevorzugt werden, da dies mit einer besseren Oberflächenfärbung der Zellen (z. B. CD3/4-Markierung) verbunden ist.
- Entnahme von Lobektomieproben von einem Pathologen (in der Regel von Patienten, die sich einer Behandlung von Lungenkrebs unterziehen). Schneiden Sie ca. 20-40 g der Probe in 3-5 mm3 Abschnitte. Legen Sie sie in eine sterile 50-μl-Kammer, bevor Sie sie mit einem geeigneten Disaggregator mechanisch fragmentieren.
- Nach der Gewebedisaggregation lysieren Sie die Erythrozyten mit 10:1 (d. h. 5 ml) 0,8 % Ammoniumchlorid (150 mM Ammoniumchlorid (NH4Cl), 1 mM Natriumbicarbonat (NaHCO3) und 0,1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)-Lösung.
Anmerkung: Alternativ kann ein automatisiertes System wie Q-prep verwendet werden.
- Resuspendieren Sie die Zellen in sterilem RPMI (das Volumen hängt von der Zellzahl ab und beträgt in der Regel 10-20 ml) und filtrieren Sie sie dann durch ein 100 μm steriles Nylonnetz. Zählen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen mit der Trypanblau-Ausschlussmethode.
>3. NTHi-Infektionstest
- Resuspendieren Sie die Lungenzellen auf eine endgültige Zellkonzentration von 4 x 106 Zellen/ml pro Röhrchen (Kontroll- und stimulierte Proben).
- Verwenden Sie eine Suspension von 4 x 106-6 x 106 Zellen in 1 ml RPMI für das (negative) Kontrollröhrchen. Verwenden Sie die gleiche Menge für das NTHi-Röhrchen (jede zusätzliche Probe kann als Positivkontrolle mit Staphylokokken-Superantigen E (SEB) verwendet werden). Infizieren Sie die Zellen im NTHi-Röhrchen mit einem MOI von 100 Bakterien pro Zelle. Lösen Sie die Kappe um eine halbe Umdrehung, um den Gastransfer in die Rohre zu ermöglichen.
- Legen Sie die Zellen in einen Röhrchenrotator und inkubieren Sie sie bei 37 °C, während Sie mit 12 U/min rotieren.
- Um den extrazellulären Export von Zytokinen zu verhindern, fügen Sie den Zellsuspensionen 1 h nach der Stimulation auf eine Endkonzentration von 10 μg/ml einen Golgi-Blocker (Brefeldin A) hinzu. Die Zellsuspensionen werden für eine weitere Inkubation von 16 bis 22 Stunden in der Rotation zurückgegeben.
- Waschen Sie die Zellsuspension mit 500 μl phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), die 1 % Rinderserumalbumin (BSA) und 0,01 % Natriumazid, NaN3, enthält.
- Fügen Sie die Antikörper für die intrazelluläre Zytokinfärbung hinzu (die Wahl der Antikörper ist vom Untersucher zu bestimmen). Färben Sie die Zellsuspension 1 h lang auf spezifische humane Lymphozyten-Zelloberflächenmarker (z. B. CD45, CD3 usw.). Waschen Sie die Zellen mit PBS, fixieren Sie sie und permeabilisieren Sie sie.
- Fixieren Sie die Zellen 1 h lang mit 500 μl 1%-2% Paraformaldehyd.
- Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer, permeabilisieren Sie 106 Zellen 15 Minuten lang mit 100 μl 0,1 % Saponin und inkubieren Sie die Zellen mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern. Waschen Sie die Zellen und analysieren Sie sie mit einem Durchflusszytometer.
Anmerkung: Die Menge der fluoreszenzmarkierten Antikörper ist spezifisch für jedes Zytokin. Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers. Typischerweise werden 106 Zellen in 100 μl Lösung 1 h lang gefärbt. Die meisten kommerziell erhältlichen Antikörper reichen aus, um 25-100 Tests durchzuführen.
- Inkubieren Sie die Zellen mit intrazellulären Zytokin-färbenden Antikörpern (z. B. Interferon-gamma, IFN-γ und Tumornekrosefaktor beta, TNF-α oder Interleukin, IL-13 und IL-17A) für 1 h.
Anmerkung: Es wird empfohlen, zuerst Oberflächenmarker und dann intrazellulär zu färben, da die Fixierung Konformationsänderungen in den Oberflächenproteinen verursachen kann, an die Antikörper binden.
- Waschen Sie die Zellen mit 500 μl PBS und resuspendieren Sie sie in 100 μl PBS, bevor Sie die Daten auf einem Durchflusszytometer erfassen.