Bestimmung der ROS-Produktion durch Neutrophile bei Wechselwirkung mit opsonisiertem Biofilm

Zusammenfassung

Quelle: Rana, P. S. J. B., et al. Standardisierte In-vitro-Assays zur Visualisierung und Quantifizierung von Wechselwirkungen zwischen humanen Neutrophilen und Staphylococcus aureus-Biofilmen. J. Vis. Exp. (2022)

In diesem Video demonstrieren wir einen in vitro Chemilumineszenz-Assay, um die Erzeugung von reaktiven Sauerstoffspezies durch Neutrophile nach Exposition gegenüber einem opsonisierten bakteriellen Biofilm nachzuweisen.

Protokoll

>1. Messung der von Neutrophilen erzeugten ROS

1. Geben Sie 100 μl 20 % normales Humanserum (verdünnt in HBSS) tropfenweise in den gewaschenen Biofilm und inkubieren Sie bei 37 °C unter statischen Bedingungen für 30 Minuten, um den Biofilm zu opsonisieren.
2. Aspirieren Sie die 20%ige Serumlösung und waschen Sie die Biofilme einmal tropfenweise mit 150 μl HBSS. Aspirieren Sie das HBSS und hinterlassen Sie Vertiefungen mit opsonisierten Biofilmen.
   Anmerkung: Für die Interpretation des Experiments wird eine Mindestanzahl von vier Gruppen empfohlen: (A) Neutrophile + Biofilm, (B) Neutrophile + PMA (Positivkontrolle, siehe Materialtabelle), (C) Nur Neutrophile und (D) Nur Biofilm.
3. Den in HBSS resuspendierten Neutrophilen wird Luminol (siehe Materialtabelle) in einer Konzentration von 4 x 10⁶ Zellen/ml zugesetzt, so dass die endgültige Luminolkonzentration 50 μM beträgt. Diese Lösung ist für die Gruppen (A) und (C) sofort einsatzbereit. Geben Sie 4 x 10⁵ mit Luminol vermischte Neutrophile in die Vertiefungen mit opsonisierten Biofilmen.
4. Bereiten Sie in einem separaten Röhrchen 50 μM Luminollösung in HBSS ohne Neutrophile vor und geben Sie sie in die Vertiefung mit dem Biofilm (Gruppe D).
5. Aliquotieren Sie 350 μl Neutrophile, gemischt mit Luminol, und fügen Sie der Mischung Phorbol-12-Myristat-13-acetat (PMA) in einer Endkonzentration von 500 ng/ml hinzu. Für Gruppe (B) werden 4 x 10⁵ Neutrophile aus dieser Mischung in Vertiefungen ohne Biofilm gegeben. Dies dient als Positivkontrolle.
   Anmerkung: Die in diesem Schritt angegebene PMA-Konzentration ist relativ hoch, um eine robuste Burst-Reaktion zu gewährleisten, da PMA-stimulierte Neutrophile eine Positivkontrolle darstellen. PMA kann je nach Experiment in einer niedrigeren Konzentration zur Aktivierung von Neutrophilen verwendet werden.
6. Die Platte bei 270 x g für 30 s bei 4 °C zentrifugieren.
7. Stellen Sie sicher, dass der Plattenleser auf 37 °C eingestellt ist, zusammen mit der Einstellung für Lumineszenz und kinetische Ablesung für 60 Minuten in 3-Minuten-Intervallen. Legen Sie die Platte in den Plattenleser, um die ROS-Produktion durch Neutrophile für 60 Minuten zu messen
   Anmerkung: Für diesen Assay wurden Biofilme in weißen Platten gezüchtet, die für Lumineszenz-Assays verwendet werden. PMA ist ein bekannter Agonist für die oxidative Burst-Reaktion. Wenn Sie Studien mit PMA durchführen, stellen Sie sicher, dass PMA im letzten Schritt zugegeben wird, während die Lösung, die Neutrophile enthält, kalt ist, da PMA sofort die Burst-Reaktion auslöst.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
50 mL konische Zentrifugenröhrchen	Thermo Scientific	339652
Alkohol-Tupfer	Bd		Wird für die Blutabnahme verwendet
Zähler für Zellen	Bal Versorgung	202C
Styroporplatten mit klarem Boden mit 96-Well-Flachboden	Costar	3370
Dulbecco-Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (DPBS) 1x	Gibco	Nr. 14190-144
Hanks' ausgewogene Salzlösung (HBSS) 1x	Corning cellgro	21-022-CV	Ohne Calcium, Magnesium und Phenolrot
Hämozytometer	Helle Linie
Luminol	Sigma	Nr. A8511-5G
Minimal essentielle Medien (MEM) Alpha 1x	Gibco	Artikel-Nr.: 41061-029
Normales Humanserum	Komplement-Technologie	Nhs
Petrischale (100 x 15 mm)	VWR	Tel.: 25384-342
Phorbol 12-Myristat-13-acetat
Poly-L-Lysin-Lösung	Sigma	Nr. P4707-50ML
SoftMax Pro Software	Molekulare Bauelemente		Mikroplatten-Reader-Software für die Datenerfassung
SpectraMax i3x	Molekulare Bauelemente		Mikroplatten-Reader

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