Methodenartikel

Ein In-vitro-Assay zur Untersuchung der Interaktion zwischen Neutrophilen und Biofilm

8. Juli 2025

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Quelle: Rana, P. S. J. B., et al. Standardisierte In-vitro-Assays zur Visualisierung und Quantifizierung von Wechselwirkungen zwischen menschlichen Neutrophilen und Staphylococcus aureus-Biofilmen. J. Vis. Exp. (2022)

Dieses Video zeigt einen in vitro Assay zur Untersuchung der Interaktion zwischen Neutrophilen und Biofilmen. Die im Biofilm eingebetteten pathogenen Bakterien und isolierten Neutrophilen wurden mit Fluoreszenzmarkierungen markiert und die Immunantwort der Neutrophilen und die Umgehung der Immunantwort durch die Bakterien mit einem Fluoreszenzmikroskop bewertet.

Protokoll

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>1. Herstellung von in vitro Biofilm

  1. Gewinnen Sie isolierte Kolonien von S. aureus aus einem kryokonservierten Bestand mit einer Streifenplattentechnik auf einer nährstoffreichen Agarplatte, wie z. B. Tryptischem Soja-Agar (siehe Materialtabelle).
  2. Beschichten Sie einzelne Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit 100 μl 0,001 % (v/v) Poly-L-Lysin (PLL), verdünnt in sterilem H2O, und inkubieren Sie es 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Aseptisch aspirieren Sie die PLL-Lösung mit einer vakuumunterstützten Aspirationsfalle. Lassen Sie die Vertiefungen über Nacht bei Raumtemperatur trocknen.
    Anmerkung: Alle Aspirationsschritte im Protokoll werden, sofern nicht anders angegeben, mit einer vakuumunterstützten Aspirationsfalle durchgeführt.
  3. Bereiten Sie eine Übernachtkultur vor, indem Sie eine Kolonie von S. aureus in minimal essentiellen Medien alpha (MEMα) inokulieren, die mit 2 % Glukose ergänzt werden, und bei 37 °C inkubieren und 16-18 Stunden lang bei 200 U/min schütteln.
  4. Verdünnen Sie die Übernachtkultur, indem Sie 50 μl auf 5 ml frisches MEMα, ergänzt mit 2 % Glukose, übertragen und bei 37 °C unter Schütteln bei 200 U/min bis zur mittleren logarithmischen Phase inkubieren, im Allgemeinen zwischen einer optischen Dichte von 600 (OD600nm) von 0,5 bis 0,8. Verwenden Sie MEMα, um die mittlere logarithmische Kultur auf einen OD600nm von 0,1 zu normalisieren.
  5. Übertragen Sie 150 μl normalisierte Kultur in jede Vertiefung der PLL-behandelten 96-Well-Platte. 18-20 h statisch in einer befeuchteten Kammer bei 37 °C inkubieren.
    Anmerkung: Die Biofilme können auch in anderen Formaten wie z.B. μ-Kanal-Objektträgern gezüchtet werden (siehe Materialtabelle).
  6. Aspirieren Sie den Überstand, um die planktonischen Zellen zu entfernen. Waschen Sie die restliche Biomasse vorsichtig mit 150 μl der Balanced Salt Solution (HBSS) von Hanks, um die nicht gebundenen Zellen zu entfernen. Fügen Sie HBSS tropfenweise hinzu, um eine Störung des Biofilms zu vermeiden.
    Anmerkung: Beim Ansaugen des Überstands und des HBSS während des Waschens gerade so viel Flüssigkeit (Überstand oder HBSS) in den Vertiefungen mit dem Biofilm belassen, dass der Biofilm noch eingetaucht ist. Dies verhindert die Störung der Biofilmstruktur, wenn HBSS tropfenweise zugegeben wird, um den Biofilm zu waschen.
  7. Wiederholen Sie Schritt 1.6 mindestens zwei weitere Male, um alle Planktonzellen zu entfernen. Zu diesem Zeitpunkt sind die Biofilme bereit für unmittelbare nachgelagerte Experimente.
    Anmerkung: Wenn die Biofilme nicht für Neutrophilenexperimente verwendet werden, kann HBSS durch phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) substituiert werden. HBSS wird PBS vorgezogen, da HBSS Komponenten enthält, einschließlich Glukose, die optimale Bedingungen für die Aktivierung von Neutrophilen bieten.

>2. Isolierung von Neutrophilen

HINWEIS: Neutrophile wurden nach einer zuvor veröffentlichten Methode mit geringfügigen Änderungen isoliert. Dieses Isolationsprotokoll kombiniert zuerst die Dichtegradientenzentrifugation, gefolgt von einer 3%igen Dextransedimentation. Dieser Abschnitt behandelt nur das gesamte Protokoll zur Isolierung von Neutrophilen und konzentriert sich auf die Änderungen, die am veröffentlichten Protokoll vorgenommen wurden. Darüber hinaus ist das unten beschriebene Protokoll eine der vielen Methoden, mit denen Neutrophile isoliert und bei Bedarf substituiert werden können. Andere Methoden zur Isolierung von Neutrophilen umfassen die Verwendung von Zelltrennmedien oder die Zelltrennung mit magnetischen Antikörpern.

  1. Entnehmen Sie einem erwachsenen Spender Blut durch Venenpunktion, gemäß dem Protokoll, das im institutionellen IRB beschrieben ist. Stellen Sie vor der Blutabnahme sicher, dass die Spritze ausreichend konservierungsmittelfreies Heparin enthält, so dass die Endkonzentration von Heparin 20 U/ml beträgt.
  2. Das heparinisierte Blut wird mit 3/4 des Volumens an endotoxinfreiem 0,9 % NaCl (siehe Materialtabelle) in H2O bei Raumtemperatur verdünnt.
  3. Pro 20 ml der verdünnten Blutprobe aliquotieren Sie 14 ml eines handelsüblichen Dichtegradientenmediums (siehe Materialtabelle) in einem frischen konischen 50-ml-Röhrchen. Schichten Sie die verdünnte Blutprobe vorsichtig auf das Dichtegradientenmedium.
  4. Zentrifugieren Sie die geschichtete Blutprobe bei 400 x g für 40 min bei Raumtemperatur. Stellen Sie sicher, dass die Zentrifuge eine langsame Pause hat, um eine Störung der Schicht nach Abschluss der Zentrifugation zu vermeiden.
    Anmerkung: Die Blutprobe besteht aus fünf Schichten, die eine Mischung aus Kochsalzlösung und Plasma, eine mononukleäre Zellschicht, ein Dichtegradientenmedium, Neutrophile und Erythrozyten enthalten.
  5. Mit einer serologischen Pipette werden alle Schichten über den Neutrophilen und dem Erythrozytenpellet aspiriert, gefolgt von einer sanften Resuspension des Pellets in kaltem Endotoxin-freiem 0,9 % NaCl in H2O. Für jedes Pellet, das aus einer 20-ml-Blutprobe erzeugt wird, resuspendieren Sie das Pellet wieder auf ein Gesamtvolumen von 20 ml. 1:1 Volumen von 3 % Dextran zugeben (siehe Materialtabelle). Inkubieren Sie das Röhrchen aufrecht für 18-20 min auf Eis.
    Anmerkung: Stellen Sie sicher, dass das 3%ige Dextran mit endotoxinfreiem 0,9 % NaCl in H2O hergestellt wird.
  6. Entfernen Sie 20 ml der oberen Schicht, die Neutrophile und einige Erythrozyten enthält, auf ein neues konisches 50-ml-Röhrchen und zentrifugieren Sie es bei 355 x g für 10 min bei 4 °C. Gießen Sie den Überstand ab, wobei ein rotes Kügelchen zurückbleibt.
  7. Resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig in 10 mL kaltem, sterilem H2O für 30 Sekunden, um die verbleibenden Erythrozyten zu lysieren. Fügen Sie der Mischung sofort 10 ml kalte endotoxinfreie 0,9%ige Kochsalzlösung hinzu, um die Spannkraft wiederherzustellen. Die Lösung bei 233 x g für 3 min bei 4 °C zentrifugieren.
  8. Gießen Sie den Überstand ab und resuspendieren Sie das Pellet mit 95 % bis 97 % Neutrophilen in 1 ml kaltem HBSS pro 20 ml Blutprobe.
  9. 10 μl der resuspendierten Neutrophilen in 90 μl 0,4 % Trypanblau-Ausschlussfarbstoff übertragen und die Zellen mit einem Hämozytometer zählen (siehe Materialtabelle).
    Anmerkung: Nicht lebensfähige Zellen werden blau gefärbt, da der Ausschlussfarbstoff Trypanblau in lebensfähigen Zellen undurchlässig ist. Dieses Protokoll bietet eine Zellviabilität von >99 %.
  10. Fügen Sie zusätzliches HBSS hinzu, so dass die Endkonzentration der Neutrophilen 4 x 106 Zellen/ml beträgt.
    Anmerkung: Bei Instanzen mit einer Zellviabilität von <99 % kann die Endkonzentration von 4 x 106 Zellen/ml immer noch erreicht werden; Das Gesamtvolumen der Lösung, die 4 x 106 Zellen/ml enthält, nimmt jedoch ab. Die Endkonzentration der Neutrophilen kann entsprechend den experimentellen Bedürfnissen des Benutzers angepasst werden. Die Neutrophilen wurden in einer Endkonzentration von 4 x 106 Zellen/ml für alle unten beschriebenen Experimente resuspendiert. Um die Variabilität von Spender zu Spender zu berücksichtigen, wird dringend empfohlen, dass alle Experimente mit Neutrophilen mit mindestens drei verschiedenen Spendern durchgeführt werden.

>3. Bildgebende Wechselwirkungen zwischen Biofilm und Neutrophilen

  1. Richten Sie einen Biofilm mit den Schritten 1.2-1.6 ein. Um die Bildgebung von Biofilmen zu erleichtern, verwenden Sie einen fluoreszierenden Stamm von S. aureus, wie z. B. USA300, das grün fluoreszierendes Protein (GFP) exprimiert, um die Mikroskopie-Bildgebung zu erleichtern.
    Anmerkung: Anstelle einer 96-Well-Platte wurde ein 6-μ-Kanal-Objektträger (siehe Materialtabelle) verwendet, um das In-vitro-Biofilmmodell zu demonstrieren (Schritt 1).
  2. 4 x 106 Zellen/ml Neutrophile werden mit 100 μM blauem CMAC (7-Amino-4-chlormethylcumarin)-Farbstoff (BCD, siehe Materialtabelle) 30 min lang in einer Wippe bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Stellen Sie sicher, dass die Proben im Dunkeln inkubiert werden, und begrenzen Sie die Lichteinwirkung für die verbleibenden Schritte.
  3. Um überschüssiges BCD zu waschen, zentrifugieren Sie die Neutrophilen 5 Minuten lang bei 270 x g und aspirieren Sie den Überstand. Resuspendieren Sie die Neutrophilen in frischem HBSS. An dieser Stelle fügen Sie den BCD-gefärbten Neutrophilen Ethidium-Homodimer-1 (siehe Materialtabelle) in einer Endkonzentration von 4 μM hinzu, um den Tod von Neutrophilen und Bakterien zu überwachen.
  4. Geben Sie 150 μl Neutrophile zu dem S. aureus-Biofilm, der in μ-Objektträgern gezüchtet wurde, so dass das Verhältnis von Neutrophilen zu Bakterien 1:30 beträgt (Neutrophile: Bakterien). Inkubieren Sie die μ-Objektträger in einer befeuchteten Kammer für 30 min. Die Anzahl der Bakterienzellen basiert auf den Zellzahlen, die durch die Beschichtung eines 18 h Biofilms gewonnen werden.
  5. Abbildung der Neutrophilen-Biofilm-Wechselwirkung mit Hilfe von Fluoreszenzkanälen, die den Anregungs- und Emissionswellenlängen der Fluoreszenzfarbstoffe/-proteine entsprechen.
    Anmerkung: Für die vorliegende Studie beträgt BCD 353/466 nm, Ethidium-Homodimer-1 528/617 nm und GFP 395/509 nm. Begrenzen Sie die Exposition der Probe gegenüber dem Laser oder dem Licht, um ein Photobleichen der Proben zu verhindern.
  6. Analysieren Sie die Bilder mit Mikroskopie-Bildanalysesoftware oder Programmen wie FIJI/ImageJ, COMSTAT2, BiofilmQ und BAIT, um nur einige mehr zu nennen.
    Anmerkung: Bei der Arbeit mit Beizen ist es wichtig, die Spezifität der verwendeten Farbstoffe zu berücksichtigen. Einige Färbungen wirken auf prokaryotische und eukaryotische Zellen, während andere nur auf eine wirken. Wenn Neutrophile und Biofilme separat mit Farbstoffen gefärbt werden, die beide Zelltypen färben können, stellen Sie sicher, dass Sie alle verbleibenden Farbstoffe abwaschen, bevor Sie Neutrophile und Biofilme kombinieren, um Kreuzfärbungen zu vermeiden.

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Offenlegungen

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Es wurden keine Interessenkonflikte angegeben.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,9 % Natriumchlorid-Bewässerung, USPBaxterArtikel-Nr.: 2F7124Frei von Endotoxinen; Wird zur Isolierung von Neutrophilen verwendet
150 mL Schnellstrom-FiltereinheitThermo ScientificTel.: 565-0020
200 Proof EthanolVWRArtikel-Nr.: 89125-188
3 mL SpritzeBd309657Wird für die Blutabnahme verwendet
50 mL konische ZentrifugenröhrchenThermo Scientific339652
60 mL SpritzeBd309653Wird für die Blutabnahme verwendet
AgarFisher BioreagenzienNr. BP1423-2
Alkohol-TupferBdWird für die Blutabnahme verwendet
PflasterWird für die Blutabnahme verwendet
BD Bacto Tryptische SojabrüheBdDF0370-07-5Kombinieren Sie es mit 1,5 % Agar, um Tryptisches Soja-Agar herzustellen
Zähler für ZellenBal Saupply202C
CellTracker blau CMCHInvitrogenNr. C2111Blauer CMAC-Farbstoff (BCD)
Styroporplatten mit klarem Boden mit 96-Well-FlachbodenCostar3370
BaumwollgazeFisherbrandTel.: 13-761-52Wird für die Blutabnahme verwendet
KulturröhrenFisherbrandTel.: 14-961-27Borosilikatglas 13 x 100 mm
D-(+)-GlukoseSigmaNr. G-8270
Dextran aus Leuconostoc spp.Sigma31392-250GWird zur Isolierung von Neutrophilen verwendet
Dulbecco-Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (DPBS) 1xGibcoNr. 14190-144
Ethidium-Homodimer-1InvitrogenL3224 B
Ficoll-Paque plusCytiva17144003Wird zur Isolierung von Neutrophilen verwendet (Dichtegradient Medium)
Hanks' ausgewogene Salzlösung (HBSS) 1xCorning cellgro21-022-CVOhne Calcium, Magnesium und Phenolrot
HämozytometerHelle Linie
HeparinNovaplusNDC 63323-540-571000 USP-Einheiten/ml, wird für die Blutabnahme verwendet
IMARIS 9.8Oxford InstrumenteBildanalysesoftware für die Mikroskopie
Minimal essentielle Medien (MEM) Alpha 1xGibcoArtikel-Nr.: 41061-029
Nadel (23 G1)Bd305145Wird für die Blutabnahme verwendet
Nikon Eclipse Ti2Nikon
NIS-ElementeNikonQuantifizierung toter Neutrophilen
Poly-L-Lysin-LösungSigmaNr. P4707-50ML
NatriumchloridFisher BioreagenzienNr. BP358-10Wird zur Isolierung von Neutrophilen verwendet
Steriles Wasser für die Bewässerung, USPBaxterArtikel-Nr.: 2F7114Frei von Endotoxinen; Wird zur Isolierung von Neutrophilen verwendet
Surflo geflügeltes InfusionssetTerumoSC*19BLK19 G x 3/4", für die Blutabnahme
Trypanblaue Beize (0,4 %)GibcoTel.: 15250-061
TurnicateWird für die Blutabnahme verwendet
Ultrareines destilliertes WasserInvitrogen10977015
Weiße, undurchsichtige 96-Well-PlattenFalke353296Mit Gewebekulturen behandelte und flache Bodenplatte
μ-Folie VI 0,4Ebd.Nr. 80601μ-Kanal-Folie
kg

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Schlagwörter

Interaktion von Neutrophilen mit BiofilmenStaphylococcus aureus BiofilmFluoreszenzmikroskopieFluoreszenzmarkierungEthidium HomodimerBCD F rbungFluoreszenz Mikroobjekttr gerreaktive SauerstoffspeziesLeukozidin ToxinFluoreszenzmikroskopie

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