Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Vorbereitung von Mäusen und DSS
- Halten Sie die Knockout-Mäuse (α-Gustducin-/-) und die auf Alter, Geschlecht und Körpergewicht abgestimmten Wildtyp-Kontrollmäuse (α-Gustducin+/+) C57BL/6 einzeln in sauberen Käfigen.
Anmerkung: Die Knockout-Mäuse werden seit über 20 Generationen mit C57BL/6-Mäusen rückgekreuzt und haben einen nahezu 100%igen genetischen Hintergrund von C57BL/6.
- 30 g Dextransulfat-Natrium (DSS)-Pulver in 1 l autoklaviertem Wasser auflösen. Mischen, bis die Lösung klar wird, um sicherzustellen, dass die endgültige Arbeitskonzentration 3 % (w/v) beträgt.
Anmerkung: Die DSS-Lösung kann bis zu 1 Woche bei Raumtemperatur oder bis zur Verwendung bei 4 °C gelagert werden.
>2. Induktion und Bewertung von DSS-Colitis bei Mäusen
- Wiegen und notieren Sie das anfängliche Körpergewicht jeder Maus. Setzen Sie die Mäuse einzeln in handelsübliche Kunststoffkäfige und beschriften Sie die Käfige.
- Ersetzen Sie normales Trinkwasser durch 3%ige DSS-Lösung für insgesamt 7 Tage, zu denen beide Gruppen von Mäusen ad libitum Zugang haben.
- Messen Sie das Körpergewicht der Maus, zeichnen Sie den Verbrauch der DSS-Lösung auf und sammeln und untersuchen Sie täglich den Stuhl jeder Maus während der DSS-Verabreichung. Beobachten Sie die Schwere von Durchfall und rektalen Blutungen und rechnen Sie diese in den DSS-induzierten Krankheitsindex um.
- Während des Experiments werden der prozentuale Gewichtsverlust im Vergleich zum Ausgangsgewicht und der Krankheitsindex berechnet, um die Symptome der Kolitis zu bewerten.
Anmerkung: Der Krankheitsindex wird durch die Kombination von Beobachtungen von Durchfall und rektalen Blutungen bewertet und ist wie folgt definiert: 0 (normaler Stuhl, kein Blut), 1 (weicher Stuhl, kein Blut), 2 (weicher Stuhl, wenig Blut), 3 (sehr weicher Stuhl, leichte Blutung) und 4 (wässriger Stuhl, starke Blutungen). Der Krankheitsindex wird täglich für jede Maus analysiert.
- Am Ende der 7-tägigen DSS-Behandlung töten Sie die Mäuse durch Gebärmutterhalsluxation und fahren Sie mit den verbleibenden Experimenten fort.
>3. Vorbereitung von Gewebeproben
- Bringen Sie die Maus in Rückenlage und reinigen Sie die Haut des Bauches mit 70% Ethanol. Machen Sie mit einer kleinen Schere einen 3 cm langen Schnitt in der Mittellinie, um die Bauchhöhle freizulegen.
- Trennen Sie die Milz vorsichtig mit einer Pinzette von anderen Geweben, entfernen Sie dann die Milz und messen Sie ihre Größe.
- Identifizieren und heben Sie den Dickdarm mit einer Pinzette an und trennen Sie ihn vom umgebenden Mesenterium. Ziehen Sie den gesamten Dickdarm heraus, bis der Blinddarm und der Enddarm sichtbar sind.
- Isolieren Sie den Dickdarm, indem Sie ihn am Kolozökalrand und tief im Becken durchschneiden, um den proximalen bzw. distalen Dickdarm zu befreien. Messen und notieren Sie dann die Länge des isolierten Doppelpunkts. Achten Sie darauf, das Dickdarmgewebe während des Präpariervorgangs nicht zu beschädigen.
- Spülen Sie den Dickdarm mit 10 ml eiskalter, phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit einer 10-ml-Spritze, die mit einer Sondennadel ausgestattet ist, um den Kot und das Blut zu entfernen, bis das Eluat vollständig frei ist.
- Für die histologische Identifizierung teilen Sie die Gewebeproben gleichmäßig in drei Teile auf: proximal, mittel und distal. Fixieren Sie das Gewebe dann über Nacht mit 4% Paraformaldehyd (PFA) bei 4 °C.
- Für die Analyse der Zytokinexpression frieren Sie den gesamten Dickdarm schnell mit flüssigem Stickstoff ein und lagern Sie ihn bis zur Verwendung bei -80 °C.
>4. Histologische Beurteilung des Schweregrads der DSS-induzierten Kolitis
- Immunhistochemie
- Tauchen Sie das Gewebe nach der Fixierung über Nacht in eine Lösung aus 30% Saccharose in 1x PBS in ein 15-ml-Röhrchen, um die Proben zu kryoschützen.
- Betten Sie das Gewebe in eine Mischung mit optimaler Schnitttemperatur (OCT) ein und legen Sie es bei -20 °C, bis das OCT aushärtet.
- Übertragen Sie den OCT-Block mit dem Gewebe in einen Kryostaten, stellen Sie den Dickenregler im Kryostaten auf 12 μm ein und schneiden und sammeln Sie 12 μm dicke Schnellschnitte.
- Erhitzen Sie die entnommenen Gewebeschnitte aus einem Kryostaten bei 65 °C für 20 min auf einer Heizplatte. Waschen Sie die Abschnitte in 1x PBS 3 Mal für jeweils 10 min. Inkubieren Sie die Gewebeschnitte 10 Minuten lang in 3% Wasserstoffperoxid, um die endogene Peroxidase zu eliminieren. Waschen Sie die Abschnitte noch 3 Mal. Blockieren Sie das Gewebe mit Blockierungspuffer (3 % Rinderserumalbumin (BSA), 0,3 % nichtionisches Detergens, 2 % Ziegenserum, 0,1 % Natriumazid in 1x PBS) bei Raumtemperatur für 1 h oder länger.
- Ersetzen Sie den Blockierungspuffer durch eine Lösung, die die folgenden immunzelltypspezifischen Primärantikörper enthält: CD45 für Leukozyten, CD3 für T-Zellen, B220 für B-Zellen, CD11b für Makrophagen und Ly6G für Neutrophile. Über Nacht bei 4 °C inkubieren.
- Entfernen Sie die primären Antikörper durch Aspiration aus Gewebeschnitten. Waschen Sie die Abschnitte 3 Mal mit 1x PBS für jeweils 10 min. Die Schnitte werden mit biotinylierten Sekundärantikörpern inkubiert, gefolgt von einer Inkubation mit dem Streptavidin-HRP-Komplex bei Raumtemperatur.
- Inkubieren Sie die Schnitte mit 3,3'-Diaminobenzidin (DAB)-Lösung, um eine hell- oder dunkelbraune Farbe zu entwickeln und die immunreaktiven Zellen sichtbar zu machen.
- Die Schnitte mit Hämatoxylin und 0,3 % (v/v) verdünntem Ammoniak gegenfärben. Nehmen Sie Hellfeldbilder mit 10-facher Vergrößerung unter dem Mikroskop auf.
- Verwenden Sie ein Bildverarbeitungsprogramm, um die Population der markierten Immunzellen sowohl im Epithel als auch in der Lamina propria (unter dem Epithel) zu identifizieren und zu quantifizieren, indem Sie 2 Masken setzen: Verwenden Sie die erste Maske in der Farbwürfel-basierten Funktion, um einen Farberkennungsschwellenwert festzulegen und die farbigen DAB-reaktiven Bereiche zu messen; verwenden Sie die zweite Maske, um die Gesamtflächen des Epithels und der laminaren Proprien im untersuchten Schnitt zu bestimmen. Exprimieren Sie die immunreaktive Zellpopulation als Verhältnis der Färbefläche der infiltrierten Zellen zur Gesamtfläche des untersuchten Gewebes.
