Abtötung von K562-Zellen durch mononukleäre Zellen des peripheren Blutes, die Tabakzubereitungen ausgesetzt waren

Zusammenfassung

Quelle: Arimilli, S. et al., Methoden zur Bewertung der Zytotoxizität und Immunsuppression von Zubereitungen aus brennbaren Tabakerzeugnissen. J. vis. exp. (2015)

In diesem Video untersuchen wir die Wirkung eines ganzen rauchkonditionierten Mediums, einer brennbaren Tabakproduktzubereitung, auf die Abtötung von K562-Zellen durch mononukleäre Zellen des Effektorsperipheriebluts.

Protokoll

>1. K562 Tötungs-Assay

HINWEIS: K562-Zellen sollten in Kultur bei 37 °C und 5 % CO₂ mit RPMI-Vollmedium gezüchtet werden, bis sie vor dem Assay eine Konfluenz von 80 % erreichen.

1. Bereiten Sie eine 5 mM Carboxyfluorescein-Succinimidylester (CFSE)-Stammlösung vor, indem Sie 18 μl DMSO in die Durchstechflasche geben.
2. Verdünnen Sie WS-CM oder Nikotin in einer 96-Well-Platte mit RPMI-Vollmedium auf ein Gesamtvolumen von 100 μl/Well, um die gewünschten Äquinikotineinheiten oder Nikotinkonzentrationen für jede Vertiefung zu erreichen.
   Vorsicht: Nikotin ist akut giftig und umweltgefährdend.
3. 100 μl PBMC in das RPMI-Komplettmedium in einer Konzentration von 1,5 x 10⁶ Zellen/Vertiefung geben. Das Gesamtvolumen der Zellen mit WS-CM oder Nikotin beträgt 200 μl/Well.
4. Die Platte zugedeckt 3 Stunden bei 37 °C und 5 % CO₂ inkubieren.
5. Waschen Sie die K562-Zellen durch Zugabe von 10 ml DPBS und zentrifugieren Sie sie bei 400 x g für 8 min bei RT.
6. Resuspendieren Sie die Zellen mit 10 ml DPBS und zählen Sie die K562-Zellen.
7. Bereiten Sie eine CFSE-Arbeitslösung vor, indem Sie 1 μl CFSE-Stammlösung zu 1 ml DPBS hinzufügen.
8. 1 ml der CFSE-Arbeitslösung zu 1 ml der K562-Zellsuspension mit 1 - 2 x 10⁷ Zellen geben. Vortex und präzise 2 min bei RT inkubieren.
9. Sofort 200 μl FBS zugeben. Vortex und präzise 2 min bei RT inkubieren.
10. Fügen Sie 10 ml RPMI Complete Medium hinzu und zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 400 x g für 8 min bei RT.
11. Entfernen Sie den RPMI-Überstand, brechen Sie das Pellet auf, resuspendieren Sie die Zellen mit 10 ml RPMI-Vollmedium und zählen Sie die CFSE-markierten K562-Zellen.
12. Die PBMCs werden gewaschen, indem die Platte bei 300 x g 3 min lang bei RT zentrifugiert wird. Der Überstand wird durch Dekantieren der Flüssigkeit abgesaugt. Setzen Sie die Abdeckung wieder auf und wirbeln Sie den Boden der Platte durch. Fügen Sie 200 μl RPMI-Vollmedium hinzu und wiederholen Sie den Waschschritt noch einmal.
13. Geben Sie CFSE-markierte K562-Zellen in einem Verhältnis von 1:15 (100.000 K562s: 1,5 x 10⁶ PBMCs) in jede Probenvertiefung der PBMC-Platte und inkubieren Sie sie 5 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO₂.
14. Waschen Sie die Zellmischung, indem Sie bei 300 x g für 3 min bei RT zentrifugieren. Aspirieren Sie den Überstand, indem Sie die Flüssigkeit verwerfen. Platzieren Sie die Abdeckung und wirbeln Sie den Boden der Platte durch.
15. Geben Sie 200 μl Laufpuffer hinzu und wiederholen Sie den in Schritt 14 beschriebenen Waschschritt noch einmal.
16. Geben Sie 95 μl Laufpuffer gefolgt von 5 μl 7AAD in jede Vertiefung, um ein Gesamtvolumen von 100 μl/Vertiefung zu erhalten. Inkubieren Sie die Platte im Dunkeln bei RT für 15 min.
17. Geben Sie 100 μl Laufpuffer in jede Vertiefung und übertragen Sie das gesamte Volumen der Zellsuspension aus jeder Vertiefung der Platte in die Cluster-Röhrchen und entnehmen Sie die Proben auf dem Durchflusszytometer.
18. Bestimmen Sie den Prozentsatz der 7AAD-positiven und CFSE-positiven Zellen mit Hilfe der Durchflusszytometrie-Analysesoftware.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
12 x 75 Röhren	BD Falke	352058
15 ml konische Röhrchen	Corning	Artikel-Nr.: 430790
2 mL Mikroröhrchen	Axygen	MCT-150-C-S
50 ml konische Röhrchen	Corning	430828
500 ml Flasche	Corning	430282
7AAD	BD Pharmingen	559925
96-Well-Platte mit flachem Boden	Termo Nunc	439454
96-Well-Rundbodenplatten	BD Falke	353077
Haube für Zellkultur	Thermo Scientific	1300 Serie A2
Zentrifuge	Eppendorf	58110R
CFSE	Molekulare Sonden Lebenstechnologien	Nr. C34554
Cluster-Röhren	Corning	Nr. 4401	Gesundheitsschädlich beim Verschlucken, krebserregend
DMSO (Dimethylsulfoxid)	Sigma-Aldrich	Nr. D8418
DPBS (Englisch)	Lonza	17-512F
FBS	Sigma-Aldrich	Nr. F2442
Filtereinheit	Nalgene	Tel.: 156-4020
Durchflusszytometer	BD Biowissenschaften	FACS Canto II	8 Farben bei Ex 405 nm und Em785 nm.
Durchflusszytometer	BD Biowissenschaften	FACS Calibur	4 Farben bei Ex 495 nm und Em 785 nm.
Software für die Analyse von Durchflusszytometrie	Baum Stern	FlowJo
Nikotin	Sigma-Aldrich	Nr. N3876	Akute Toxizität, Gefahr für die Umwelt
Parafilm	Bemis	"M"
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	Nr. P6148	Entzündlich, Hautreizungen
Stift/Streptokokken	Gibco Life Technologien	Nr. 15140-122
RPMI 1640	Gibco Life Technologien	Artikel-Nr.: 11875-093
Laufender Puffer	MACS Laufpuffer, Miltenyi Biotech	Tel.: 130-091-221
Pipette übertragen	Fisher Scientific	Tel.: 13-711-20
Tris Basis	Sigma-Aldrich	Nr. T1503