>1. Synthetisches Mukoviszidose-Medium (SCFM2) vorbereiten
HINWEIS: Die Vorbereitung von SCFM2 besteht aus drei Hauptphasen, die unten beschrieben sind (Abbildung 1).
- Sterilisation von Schweinemuzin
- Bereiten Sie steriles Mucin in einer Endkonzentration von 5 mg/ml in SCFM2 vor. Wiegen Sie beispielsweise für ein Volumen von 5 ml SCFM2 25 mg Typ-II-Muzin in einer sterilen Petrischale und legen Sie es für 4 Stunden in einen UV-Sterilisator und rühren Sie es stündlich sanft um.
- Nach 4 Stunden wird das UV-behandelte Muzin unter sterilen Bedingungen in autoklavierte 1,7-ml-Röhrchen überführt und bei -20 °C gelagert.
- Um die vollständige Sterilisation zu bestätigen, lösen Sie eine Muzinprobe in einer sterilen Flüssigkeit wie Wasser oder Luria-Bertani (LB)-Brühe auf und betrachten Sie sie unter einem Mikroskop.
Anmerkung: Sterilisiertes Mucin kann bis zu 6 Monate bei -20 °C gelagert werden.
- Vorbereitung des gepufferten Bodens
- Bereiten Sie Salz- und Aminosäure-Stammlösungen vor, indem Sie die entsprechenden Gewichtsmengen zu deionisiertem Wasser hinzufügen, wie in Tabelle 1 aufgeführt. Alle Stammlösungen mit einem 0,22-μm-Filter filtrieren, zum Schutz vor Lichtdegradation in Folie einwickeln und bis zu einem Monat bei 4 °C lagern.
- Bereiten Sie die gepufferte Base vor, indem Sie 190 ml deionisiertes Wasser mit Aminosäure- und Salz-Stammlösungen in den in Tabelle 1 aufgeführten Volumina kombinieren. Stellen Sie die Lösung auf einen pH-Wert von 6,8 ein und erhöhen Sie sie auf ein Endvolumen von 250 ml. Mit einem 0,22-μm-Filter filtrieren und bis zu 30 Tage bei 4 °C lagern.
- Am Abend vor dem Versuch aliquotieren Sie die gewünschte Menge gepufferter Base in einen Glaskulturkolben und fügen Sie Mucin (5 mg/ml, wie in Schritt 1.1.1 beschrieben) und gereinigte Lachsspermien-DNA (0,6 mg/ml) hinzu. Vorsichtig umrühren, in Folie einwickeln und über Nacht bei 4 °C ruhen lassen, damit sich Muzin und DNA in Lösung auflösen können.
Anmerkung: DNA-Aliquots von Lachsspermien sollten auf Eis aufgetaut, vortexiert und zu gepufferter Base und Mucin hinzugefügt werden. Stammlösungen aus Tryptophan, Asparagin und Tyrosin müssen in NaOH-Lösungen (Konzentrationen siehe Tabelle 1) anstelle von deionisiertem Wasser hergestellt werden. Bewahren Sie die gepufferte Base und alle Stammlösungen in Folie eingewickelt auf, um sie vor Lichteinwirkung zu schützen. Die meisten Aktien bleiben bis zu einem Monat lang stabil. Schäfte, die sich verfärben, sollten nicht verwendet werden und vor Gebrauch ausgetauscht werden.
- Zugabe von Zusatzbeständen
- Am Tag des Versuchs werden die in Tabelle 2 aufgeführten Stämme zu der gepufferten Base hinzugefügt, die Muzin und DNA enthält.
Anmerkung: Bereiten Sie am Tag des Versuchs eine frische FeSO-4-Lösung vor, aber alle anderen Brühen können im Voraus hergestellt und 30 Tage lang bei 4 °C gelagert werden. 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DOPC) enthält Chloroform. Mit Vorsicht behandeln und nicht in der Nähe von offenem Feuer verwenden. Nach der Zugabe von DOPC ist SCFM2 bei 37 °C unter Schütteln (250 U/min) für mindestens 20 Minuten zu inkubieren (für 5 mL Kultur). Diese Inkubationszeit ermöglicht es dem Chloroform im DOPC zu verdampfen. Der Kolben sollte nicht luftdicht sein; Decken Sie stattdessen die Kolbenöffnung locker mit Folie ab.
>2. Echtzeitbewertung der Antibiotikatoleranz in Bakterienaggregaten
- Bereiten Sie Kulturen über Nacht vor
- Am Vorabend des Experiments werden 5 ml LB-Bouillon mit mehreren Kolonien Pa PAO1-pMRP9-113 von einer LB-Agarplatte, die ein Antibiotikum (Carbenicillin 300 μg/ml) enthält, inokuliert. Anbau über Nacht bei 37 °C und Rühren bei 250 U/min.
Anmerkung: Züchten Sie Übernachtkulturen unter Zugabe von Antibiotika, die für die Auswahl der erforderlichen Plasmide erforderlich sind (hier das grün fluoreszierende Protein (GFP)-Expressionsplasmid, pMRP9-1). Es ist zu beachten, dass Pa-Zellen vor der Inokulation von SCFM2 gewaschen werden müssen. LB kann durch andere reichhaltige Labormedien für Übernachtkulturen ersetzt werden. Alle Bakterienisolate sollten in diesem Protokoll unter Beachtung der entsprechenden BSL-2-Richtlinien behandelt werden.
- SCFM2 impfen
- Am Tag des Versuchs werden Übernachtkulturen mit Pa 1:10 (Kultur: flüssige Medien) rückverdünnt, indem 500 μl in 5 ml frische LB-Brühe geimpft werden. Züchten Sie die Zellen bis zur logarithmischen Phase (60-90 min) bei 37 °C und rühren Sie bei 250 U/min.
- Zentrifugieren Sie Kulturen in der logarithmischen Phase bei 10.000 × g für 5 Minuten. Waschen Sie die Zellen, indem Sie den Überstand entfernen und in 3 ml filtersterilisierter, phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,0) resuspendieren. Wiederholen Sie dies zweimal und resuspendieren Sie das Pellet in einem Endvolumen von 1 ml PBS.
- Messen Sie die Absorption der gewaschenen Zellen mit einem Spektralphotometer bei 600 nm (OD600) und berechnen Sie das Kulturvolumen, das für eine Anfangs-OD600 von 0,05 in 5 ml SCFM2 erforderlich ist. Inokulieren Sie Pa in das SCFM2 und wirbeln Sie es sanft auf, um die Zellen überall zu verteilen. Pipettieren Sie 1 ml des inokulierten SCFM2 in jede Kammer einer optischen 4-Well-Schüssel mit Glasboden und inkubieren Sie es 4 Stunden lang statisch bei 37 °C.
Anmerkung: Die Verdopplungszeit von Pa-Kulturen ist abhängig vom Stamm und der Verfügbarkeit von Sauerstoff. In SCFM2 beträgt die Verdopplungszeit von Pa unter den hier beschriebenen Bedingungen ~1,4 h.
>3. Visualisierung von Aggregaten während der Antibiotikabehandlung mit konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM)
HINWEIS: Dieser Abschnitt beschreibt die Verwendung von konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopen und Bilderfassungssoftware für die Abbildung von Pa-Aggregaten in SCFM2. Ziel ist es, die verbleibende (tolerante) bakterielle Biomasse nach der Behandlung mit Antibiotika zu beobachten und zu charakterisieren. Die beschriebenen Schritte können mit Erfolg an anderen konfokalen Mikroskopen durchgeführt werden, obwohl für spezifische Anleitungen auf die Bedienungsanleitung des Instruments verwiesen werden sollte.
- Stellen Sie Pa-Kulturen vor, indem Sie entweder eine beheizte Kammer oder eine beheizte Mikroplatte verwenden, die auf dem Mikroskoptisch angebracht ist, um eine Umgebungstemperatur von 37 °C aufrechtzuerhalten. Starten Sie das Inkubationsmodul mindestens 2 Stunden vor Beginn des Experiments, damit alle Geräte die gewünschte Temperatur erreichen können und weitere Ausdehnungen und Bewegungen während der Datenerfassung reduziert werden.
- Nach 4 Stunden werden SCFM2-Kulturen, die Pa-Zellen enthalten, auf den beheizten Mikroskoptisch übertragen. Bezeichnen Sie 3 von 4 Vertiefungen als technische Replikate für die Antibiotikabehandlung und betrachten Sie die vierte Vertiefung als behandlungslose Kontrolle, die nur Pa-Zellen in SCFM2 ohne Antibiotika enthält. Identifizieren Sie Aggregate mit Hilfe der Hellfeldmikroskopie auf der Registerkarte "Orten", bevor Fluoreszenzreporter angeregt werden. Definieren Sie einen Bereich für die Bildgebung innerhalb jedes Wells und speichern Sie dessen Position (x-y-z-Koordinaten) mit dem Modul "Positionen" in der Imaging-Software.
- Verwenden Sie ein 63-faches Öl-Immersionsobjektiv, um Pa-Kulturen zu visualisieren, die das GFP-Expressionsplasmid pMRP9-1 in SCFM2 mit einer Anregungswellenlänge von 488 nm und einer Emissionswellenlänge von 509 nm enthalten. Nehmen Sie Bilder mit der Option "Z-Stapel" im Erfassungsmodul in Abständen von 1 μm auf (insgesamt 60 Schichten). Verwenden Sie das Line-Amittelaging-Modul, um die Hintergrundfluoreszenz im GFP-Kanal innerhalb des Gesamtvolumens der 60-μm-Z-Stack-Bilder (1.093,5 mm3) zu reduzieren. Nehmen Sie Kontrollbilder von ungeimpftem SCFM2 auf, indem Sie identische Einstellungen verwenden, um die Hintergrundfluoreszenz für die Bildanalyse zu bestimmen.
Anmerkung: Bilder werden aufgenommen, indem 8-Bit-Z-Stapel-Bilder mit einer Größe von 512 x 512 Pixeln (0,26 μm x 0,26 μm Pixel) erzeugt werden, die 60 μm von der Unterseite des Deckglases entfernt sind.
- Verwenden Sie die Zeitreihenoption in der Bildgebungssoftware, um 60 Schichten an jeder Position (Well) in 15-Minuten-Intervallen über einen Zeitraum von 18 Stunden zu erfassen. Verwenden Sie die Definite-Focus-Strategie in der Software, um für jede Position eine Fokusebene zu speichern, zu der zu jedem Zeitpunkt während des Experiments zurückgekehrt wird.
- Nach insgesamt 4,5 Stunden Inkubation wird jede Position mit den obigen Einstellungen abgebildet, um die Gesamtbiomasse in jeder der vier Vertiefungen vor der Zugabe des Antibiotikums zu bestimmen.
- Nach 6 Stunden Gesamtinkubation fügen Sie jedem Replikat ein Antibiotikum in einer 2x niedrigeren minimalen Hemmkonzentration (MIC) hinzu. Pipettieren Sie direkt und vorsichtig in die Mitte der Vertiefung, direkt unter der Luft-Flüssigkeits-Zwischenphase. Bewahren Sie alle Kulturen in der beheizten Konfokalkammer auf.
Anmerkung: Hier wurde Colistinsulfat in einer Konzentration von 140 μg/mL verwendet.
- Beginnen Sie mit der Bildgebung nach der Antibiotikabehandlung, indem Sie im Bildgebungsprogramm auf die Option Experiment starten klicken.
Anmerkung: Die verwendete Antibiotikakonzentration hängt vom Antibiotikum, dem Pa-Isolat, ab und davon, ob der Anwender Abtötungs- oder Verträglichkeitseffekte untersuchen möchte. Bei diesem Experiment wird eine Einzeldosis verwendet. Bei Bedarf können zusätzliche Dosen hinzugefügt werden, ohne die Kulturen zu stören.
>4. Propidiumiodid-Färbung von Pa-Aggregaten
HINWEIS: Propidiumiodid (PI) wird häufig als Färbereagenz verwendet, um nicht lebensfähige (tote) Bakterienzellen in Kultur zu identifizieren. Hier wird es verwendet, um Aggregate zu identifizieren, die empfindlich auf die in Abschnitt 3 angewendete Antibiotikabehandlung reagieren. In diesem Protokoll wird die Expression und der Nachweis von GFP in Pa-Zellen als Hauptproxy für die Lebensfähigkeit der Zellen verwendet. Dieser letzte Schritt ermöglicht es, die konfokale Bildgebung erneut zu verwenden, um die räumliche Positionierung von lebenden und toten Aggregaten zueinander zu identifizieren. Zusätzlich werden Aggregate für die weitere nachgelagerte Zellsortierung in Abschnitt 3 als lebend/tot identifiziert.
- Nach 18 Stunden wird PI in jede Vertiefung der optischen Vierkammer-Bodenschale mit SCFM2-Kulturen gegeben. Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers für das PI-Volumen und die Inkubationszeit (z. B. ~2 μl pro mL Kultur, ~20-30 min).
>5. Isolierung lebender Zellen aus Aggregaten mit einem Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierungsansatz (FACS)
HINWEIS: FACS stellt eine leistungsstarke Plattform dar, um Zellgruppen nach einem fluoreszenzmarkierten Phänotyp zu sortieren und zu isolieren. Hier wird FACS eingesetzt, um lebende (antibiotikatolerante) Aggregate aus nicht lebensfähigen Aggregaten zu isolieren.
- Nach der Färbung mit Propidiumiodid nehmen Sie die Kulturen aus der Inkubation und geben Sie sie in einem isolierten Behälter auf ein FACS-Instrument, um eine Temperatur von 37 °C aufrechtzuerhalten.
- Führen Sie 1 ml Aliquots von SCFM2 mit Pa-Aggregaten bei der niedrigsten Flussrate durch.
Anmerkung: Jedes Aliquot enthält ~15.000 Aggregate.
- Um GFP zu detektieren, beleuchten Sie die Zellen mit einem 488-nm-Laser und zeichnen Sie die Fluoreszenzsignalhöhe bei 530/30 nm auf. Visualisieren Sie die PI-Färbung durch Anregung mit einem 561-nm-Laser und zeichnen Sie die Fluoreszenzsignalhöhe bei 610/20 nm auf. Führen Sie die Sortierung mit einer 70-HE-Düse durch.
Anmerkung: Sortierte Aggregate können je nach Anwendung des Benutzers auf verschiedene Weise zusammengefasst werden. In diesem Fall wurde FACS verwendet, um lebensfähige Pa-Aggregate für die nachgeschaltete RNA-Sequenzierung zu sortieren.
Tabelle 1: Zubereitung von Salz-, Aminosäure-, DNA- und Muzin-Stämmen, die für die gepufferte Base des synthetischen Mukoviszidose-Sputummediums, SCFM2, benötigt werden.
kg
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kg
kg
kg
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kg
kg
| chemisch | Bestandskonzentration (m) | Endkonzentration (mM) | Notizen |
| NaH2PO4 | 0,2 | 1.3 | |
| Na2HPO4 | 0,2 | 1,25 | |
| KNO3 | 1 | 0,35 | |
| K2SO4 | 0,25 | 0,27 | |
| NH4Cl | | 2,28 | Fügen Sie den Feststoff direkt zur gepufferten Basis hinzu |
| Kcl | | 14,94 | Fügen Sie den Feststoff direkt zur gepufferten Basis hinzu |
| NaCl | | 51,85 | Fügen Sie den Feststoff direkt zur gepufferten Basis hinzu |
| MOPS | | 10 | Fügen Sie den Feststoff direkt zur gepufferten Basis hinzu |
| Ser | 0,1 | 1,45 | |
| Glu HCl | 0,1 | 1,55 | |
| Profi | 0,1 | 1,66 | |
| Gly | 0,1 | 1.2 | |
| Ala | 0,1 | 1,78 | |
| Val | 0,1 | 1,12 | |
| traf | 0,1 | 0,63 | |
| Ile | 0,1 | 1,12 | |
| Leu | 0,1 | 1,61 | |
| Orn HCl | 0,1 | 0,68 | |
| Lys HCl | 0,1 | 2,13 | |
| Arg HCl | 0,1 | 0,31 | |
| Trp | 0,1 | 0,01 | Zubereitet in 0,2 M NaOH |
| Natter | 0,1 | 0,83 | Zubereitet in 0,5 M NaOH |
| Tyr | 0,1 | 0,8 | Zubereitet in 1,0 m NaOH |
| FR | 0,1 | 1,07 | |
| Cys HCl | 0,1 | 0,16 | |
| Phe | 0,1 | 0,53 | |
| Sein HCl H2O | 0,1 | 0,52 | |
| Lachs-Spermien-DNA | | 0,6 mg/ml | |
| Schleim für Schweine | | 5 mg/nL | |
Tabelle 2: Vorbereitung zusätzlicher Bestände für die gepufferte Basis des synthetischen Mukoviszidose-Sputummediums, SCFM2.
kg
kg
kg
kg
kg
kg
Nach
| chemisch | Bestandskonzentration (M) | Endkonzentration (mM) | Notizen |
| Dextrose (D-Glu2cose) | 1 | 3 | |
| L-Milchsäure | 1 | 9,3 | Mit NaOH auf pH 7,0 einstellen |
| CaCl2*H2O | 1 | 1,75 | |
| MgCl2*6H2O | 1 | 0,61 | |
| FeSO4*7H2O | 1 mg/ml | 0,0036 | Täglich frisch zubereiten |
| N-Acetylglucosamin | 0,25 | 0,3 | |
| 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocolin (DOPC) | 25 mg/ml | 100 μg/ml | Zugabe mindestens 20 min bei 37 °C inkubieren |
