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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
1. Zellen auf eine Infektion vorbereiten
- Die Maus-Makrophagen-ähnliche Zelllinie RAW 264.7 wird in DMEM-Gewebekulturmedien vermehrt, die mit 10 % fötalem Kälberserum (im Folgenden als DMEM/FCS bezeichnet) unter Verwendung eines 125-ml-Kolbens und eines Gewebekultur-Inkubators, der bei 37 °C/5 % CO2 gehalten wird, ergänzt.
- Am Tag vor der Infektion werden die Zellen mit einem Zellschaber aus dem Expansionskolben entnommen und in einem konischen Röhrchen mit 15-ml-Schraubverschluss gesammelt. Zellen bei 800 x g für 10 min zentrifugieren, Überstand dekantieren, das Zellpellet in 1 mL DMEM/FCS (ohne Antibiotika) suspendieren und den Titer mit einem Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzähler bestimmen.
- Stellen Sie den Titer auf 2 x 106 Zellen/ml ein und geben Sie 0,10 ml (2 x 105 Zellen) in die Vertiefungen einer 48-Well-Gewebekulturschale. Stellen Sie sicher, dass die Zellsuspension die gesamte Oberfläche des Wells bedeckt.
- Plattenzellen in zusätzlichen Vertiefungen für eine spätere Quelle für konditionierte Medien. Platzieren Sie außerdem 0,10 ml DMEM/FCS in drei zusätzliche Vertiefungen, um als "No-Cell-Control" zu dienen.
Über - Nacht in einem Gewebekultur-Inkubator bei 37 °C/5 % CO2 inkubieren. Am nächsten Tag nicht aus dem Inkubator nehmen, bis das Bakterium-Inokulum vorbereitet und gebrauchsfertig ist.
2. Vorbereitung von Listeria monocytogenes (Lm) auf eine Infektion
- 2 ml Gehirn-Herz-Infusion (BHI) mit einer einzigen Kolonie aus einer frisch gestreiften Agarplatte (<2 Tage) Lm inokulieren und über Nacht bei 37 °C und Schütteln bei 130 Umdrehungen/min inkubieren.
- Am nächsten Tag werden 0,10 ml Nachtkultur zu 2 ml vorgewärmtem BHI hinzugefügt und bei 37 °C unter Schütteln weiter inkubiert, bis die optische Dichte (OD600) zwischen 0,4 und 0,6 liegt.
- Bestimmen Sie den ungefähren Bakterientiter mit einer empirisch abgeleiteten Umrechnungsformel. In unserem Labor beträgt eine exponentiell wachsende Lm-Kultur in BHI etwa 1,3 x 109 koloniebildende Einheiten (KBE)/OD600. Minimieren Sie die Zeit, in der Bakterienkulturen Raumtemperatur ausgesetzt sind.
- Kurz vor der Infektion den Titer auf 5 x 107 KBE/ml mit vorgewärmtem DMEM/FCS als Verdünnungsmittel einstellen.
>3. Infektion
- Schnell und präzise 20 μl (1 x 106 KBE; Multiplizität der Infektion, MOI = 5) des frisch zubereiteten Lm-Inokulums (Schritt 2.4 oben) in die Vertiefungen geben, indem Sie die Schale leicht kippen und die Pipettenspitze vorsichtig in das darüber liegende Medium legen
HINWEIS: Vermeiden Sie es, die Wände der Vertiefung mit der Pipettenspitze zu berühren.
- Pipettieren Sie den Inhalt jeder Vertiefung vorsichtig, um eine vollständige Durchmischung zu gewährleisten. Schütteln oder kippen Sie die Platte nicht erheblich, da dies Lm über die Wände der Vertiefung verteilt. Stellen Sie die Zellkulturschale wieder in einen 37 °C/5 % CO2 -Inkubator.
- Bereiten Sie eine 10 μg/ml Gentamicinlösung unter Verwendung von konditionierten Medien aus nicht infizierten Vertiefungen als Verdünnungsmittel her.
- 30 Minuten nach der Infektion (mpi) vorsichtig 30 μl der Gentamicin-Lösung (Endkonzentration 2,5 μg/ml) hinzufügen, den Inhalt der Vertiefung wie zuvor vorsichtig pipettieren und die Zellkulturschale wieder in den 37 °C/5 % CO2 -Inkubator stellen.
- Bei 60 mpi sind geeignete Vertiefungen für die CFU-Analyse (60 mpi Zeitpunkt) oder die FCM-Analyse (wie in den Abschnitten 4 bzw. 5 beschrieben) zu entnehmen.
- Für die verbleibenden Vertiefungen wird zu verschiedenen Zeitpunkten danach entweder wie zuvor Zellen entnommen oder, für den Lm-Emergenz-Assay, das Medium vollständig aus dem Vertiefung entfernt und durch 150 μl gentamicinfreies konditioniertes Medium ersetzt.
>4. Probenahme, Verarbeitung und Analyse von intrazellulärem und emergentem lm mittels CFU-Assay
- Um zu ernten, kippen Sie die Schale leicht und nehmen Sie vorsichtig das gesamte Medium aus der Mulde. 0,50 ml destilliertes steriles Wasser (dsH2O) in die Vertiefung geben. Nach 30 s wird das resultierende Wasserlysat (100) in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführt und 10 s lang kräftig vortext.
- Bereiten Sie 10-1 und 10-2 Verdünnungen vor, indem Sie entweder 4,5 μl oder 50 μl des Wasserlysats zu 450 μl dsH2O hinzufügen und kurz vortexen, um eine gründliche Durchmischung zu gewährleisten.
- 50 μl der 10,0, 10-1 und/oder 10-2 Proben werden auf Lysogeny Broth (LB)-Agarplatten verteilt.
- Um auf emergentes Lm zu untersuchen (Schritt 3.6 oben), entfernen Sie 10 μl des überlagernden Mediums und teilen Sie es in zwei 5-μl-Aliquots auf: Zu einem Aliquoten fügen Sie 5 μl DMEM/FCS und zu dem zweiten Aliquot 5 μl DMEM/FCS mit 5 μg/ml Gentamicin hinzu. Bei letzterer Kontrolle wird im nachfolgenden CFU-Assay zwischen extrazellulärem Lm (Gentamicin-sensitiv) und intrazellulärem Lm (Gentamicin-resistent) unterschieden.
- Nach 5 min bei Raumtemperatur 90 μl dsH2O zugeben, 10 s kräftig wirbeln und 50 μl auf LB-Agarplatten verteilen.
- Zählung der Lm-Kolonien auf LB-Agarplatten nach 2-tägiger Inkubation bei 37 °C.