Durchflusszytometrische Analyse von intrazellulären und emergenten extrazellulären Listeria monocytogenes in vitro

Zusammenfassung

Quelle: Gayle, P. et al., Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-Level Host Responses. J. Vis. Exp. (2019)

In diesem Video quantifizieren wir intrazelluläre und extrazelluläre Listeria monocytogenes, ein intrazelluläres pathogenes Bakterium, nach ihrer Infektion von kultivierten Makrophagen in vitro mittels Durchflusszytometrie.

Protokoll

>1. Probenahmeverarbeitung und Analyse von intrazellulärem und emergentem LM mittels Durchflusszytometrie (FCM)

1. Die Maus-Makrophagen-ähnliche Zelllinie RAW 264.7 wird in DMEM-Gewebekulturmedien hergestellt, die mit 10 % fötalem Kälberserum (im Folgenden als DMEM/FCS bezeichnet) ergänzt werden, unter Verwendung eines 125-ml-Kolbens und eines Gewebekulturinkubators, der bei 37 °C/5 % CO₂ gehalten wird. Stellen Sie die Zellen auf 1 x 10⁶ Zellen/ml ein und geben Sie 1 ml (1 x 10⁶ Zellen) in die Vertiefungen einer 6-Well-Gewebekulturschale.
2. Bereiten Sie Listeria monocytogenes, Lm, Bakterium inokulum vor und infizieren Sie Zellen mit einem Inokulumvolumen, das einem MOI von 50 (5 x 10⁷ KBE) entspricht.
3. 1,5 Stunden nach der Infektion (hpi) das Medium aus dem ersten Well-Set auffangen und in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit 500 μl 4 % Paraformaldehyd (PFA) geben und auf Eis legen, bis alle Wells verarbeitet sind.
4. Um intrazelluläres Lm zu sammeln, geben Sie 1 mL ds H₂O in die Vertiefung und überführen Sie das resultierende Wasserlysat nach 60 s in ein 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen mit 500 μl 4 % PFA. 10 Sekunden lang kräftig vortexen und auf Eis legen, bis alle Vertiefungen bearbeitet sind.
5. Entfernen Sie bei den verbleibenden Vertiefungen das Medium und ersetzen Sie es durch 1 ml DMEM/FCS mit 5 μg/ml Gentamicin, um extrazelluläres Lm abzutöten und die Zellen unverzüglich in den Inkubator zurückzubringen.
6. Nach 30 min (2 hpi) das Medium entfernen und durch DMEM/FCS ohne Gentamicin ersetzen.
7. Nach 2 und 4 h (4 und 6 hpi) nehmen Sie den zweiten und dritten Zeitpunkt, indem Sie Medien und Lysate sammeln.
8. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 10.000 x g für 7 min. Entfernen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören.
9. Jedes Pellet wird in einem Färbecocktail aus 50 μl 4 % PFA und 15 μl Phalloidin suspendiert. Röhrchen im Dunkeln bei 4 °C für 20 min inkubieren.
10. Nach der Inkubation 1 ml FACS-Puffer in jedes Röhrchen geben und zum Mischen auf und ab pipettieren.
11. Röhrchen bei 10.000 x g für 7 min schleudern. Überstand entfernen, ohne das Pellet zu stören.
12. Suspendieren Sie jedes Pellet in 400 μl FACS-Puffer zur sofortigen Verwendung oder 200 μl FACS-Puffer und 200 μl 4 % PFA, wenn es für eine spätere Analyse gelagert wird.
13. Führen Sie Proben mit Durchflusszytometrie durch und analysieren Sie die gesammelten Daten.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
BHI-Brühe (Brain Heart Infusion)	EMD Milipore	110493
Zellsieb, 70 μm	VWR	Tel.: 10199-656
Kollagenase D	Roche	11088858001
DMEM-Medien	Gibco	Nr. 11965-092
FACS-Röhren	BD Falke	352054
FBS - Hitzeinaktiviert	Sigma-Aldrich	Nr. F4135-500ML
Hanks' ausgewogene Salzlösung	Sigma-Aldrich	H6648-6X500ML
LB-Agar	Zellen züchten MS	MBPE-4040
LIVE/DEAD Fixierbares gelbes Fleckenset für tote Zellen	Lebenstechnologien	Nr. L349S9
Rhodamin Phalloidin	Thermo Fischer	Nr. R415
SP6800 Spektral-Analysator	Sony
TPP Gewebekultur 48-Well-Platten	MIDSCI	TP92048
TPP Gewebekultur 6-Well-Platten	MIDSCI	TP92406