>1. Fliegen sammeln und vorbereiten
- Drosophila melanogaster unter den gewünschten Versuchsbedingungen aufziehen. Achten Sie darauf, die Fliegen während der Aufzucht nicht zu überbevölkern, und stellen Sie sicher, dass die Larvendichten bei allen Behandlungen gleich sind, da die Umweltbedingungen während des Larvenstadiums die Phänotypen der Immunabwehr im Erwachsenenstadium tiefgreifend beeinflussen können.
- Sammeln Sie Versuchsfliegen 0 - 3 Tage nach der Eklosion aus der Puppenhülle und übertragen Sie sie auf frisches Medium.
- Halten Sie die gesammelten Fliegen bei der gewünschten Temperatur (Temperaturen zwischen 22 °C und 28 °C sind in der Regel geeignet), bis sie 5 - 7 Tage nach der Eklosion alt sind.
Anmerkung: Dies gibt den Fliegen genügend Zeit, die Metamorphose abzuschließen und zu reifen Erwachsenen zu werden, ist aber lange bevor die Seneszenz beginnt.
- Sortieren Sie die gewünschte Anzahl von Fliegen vor der Infektion in ein separates Fläschchen und achten Sie auch hier darauf, dass es nicht zu einer Überfüllung kommt.
Anmerkung: In dieser Demonstration werden nur Männchen infiziert, aber es ist ebenso möglich, Weibchen mit dem beschriebenen Verfahren zu infizieren.
>2. Bakterien kultivieren und vorbereiten
- Bereiten Sie mindestens 2 Tage vor der Infektion eine Masterplatte der ausgewählten Bakterien vor. Streichen Sie die Bakterien aus einem 15%igen Glycerinvorrat, der auf unbestimmte Zeit bei -80 °C gelagert wurde. Lagern Sie die Masterplatte bis zu 2 Wochen lang bei 4 °C. Streifen Sie die Masterplatten immer direkt aus dem gefrorenen Glycerinvorrat. Vermeiden Sie die serielle Passage von Bakterien von Platte zu Platte, da eine wiederholte Passage in Kultur dazu führen kann, dass Bakterien eine abgeschwächte Virulenz entwickeln.
Anmerkung: In diesem Beispiel werden Providencia rettgeri und Escherichia coli verwendet.
- Gehen Sie wie folgt vor, um eine bakterielle Suspension für die Injektion vorzubereiten.
- Züchten Sie eine 2-ml-Bakterienkultur, indem Sie ein steriles Medium mit einer einzigen Kolonie beimpfen, die von der Master-Platte isoliert wurde. Züchten Sie die Bakterien in die stationäre Phase (z. B. O/N-Wachstum bei 37 °C).
Anmerkung: Sowohl P. rettgeri als auch E. coli wachsen gut in Luria-Bouillon bei Temperaturen von 20 - 37 °C bei leichtem Schütteln.
- Sobald die Kultur die stationäre Phase erreicht hat, pelletieren Sie Zellen aus ca. 600 μl der Kultur vorsichtig in einer Tischzentrifuge (3 min bei 5.000 x g), verwerfen den Überstand und resuspendieren die Bakterien in ca. 1.000 μl steriler, phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS; 137 mM Natriumchlorid, NaCl, 2,7 mM Kaliumchlorid, KCl, 10 mM Natriumphosphat, Na2PO4, 1,8 mM Kaliumdihydrogenphosphat, KH2PO4, pH = 7,4).
- Verdünnen Sie die resuspendierten Zellen in sterilem PBS, um eine für das verwendete Bakterium geeignete optische Dichte (OD) zu erreichen, die mit einem Spektralphotometer als Extinktion bei 600 nm gemessen wird. Verwenden Sie diese Suspension, um die Fliegen zu infizieren.
Anmerkung: A600 = 0,1 bzw. 1,0 entspricht ungefähr 10,8 und 10,9 Providencia rettgeri oder E. coli pro ml. Da sowohl lebende als auch tote Bakterien zur optischen Dichte beitragen, ist es wichtig, Kulturen früh in der stationären Phase zu ernten, bevor sich Bakterienkörper ansammeln und das Verhältnis zwischen optischer Dichte und der Anzahl lebensfähiger Bakterien, die während der Infektion eingeführt werden, verzerren.
>3. Infizieren Sie die Fliegen
HINWEIS: Da die Immunität von Drosophila durch den zirkadianen Rhythmus beeinflusst wird, ist es wichtig, Infektionen zu einer ähnlichen Tageszeit bei experimentellen Replikaten durchzuführen.
- Verwendung eines Nanoinjektors
- Bereiten Sie die Glasnadeln auf die Infektion vor.
- Bereiten Sie eine Glasnadel vor, indem Sie mit einem Mikropipettenzieher an einer Kapillare aus Borosilikatglas ziehen.
- Brechen Sie mit einer Pinzette die Spitze der Nadel ab, um eine Öffnung von ca. 50 μm Durchmesser zu schaffen, die den Ausstoß der Flüssigkeit ermöglicht.
- Montieren Sie den Injektor.
- Setzen Sie den Dichtungs-O-Ring und dann den weißen Abstandshalter (große Vertiefung nach außen) auf den Metallkolben.
- Füllen Sie die Glasnadel mit einer Spritze mit einer 30 g Nadel mit Mineralöl.
- Führen Sie die gefüllte Glasnadel durch die Spannzange und platzieren Sie dann den größeren O-Ring um die Basis, etwa 1 mm vom stumpfen Ende der Nadel entfernt.
- Schieben Sie die Nadel auf den Metallkolben und schrauben Sie die Spannzange vorsichtig fest, bis sie fest sitzt.
- Werfen Sie den größten Teil des Mineralöls aus dem Injektor aus, aber stellen Sie sicher, dass sich noch ein kleines Volumen Öl in der Nadel befindet, das als Barriere zwischen dem Injektor und der Bakteriensuspension fungiert. Achten Sie darauf, dass sich keine Luftblasen im Mineralöl oder in der Bakteriensuspension oder zwischen den beiden Flüssigkeiten befinden.
- Stellen Sie den Injektor auf das gewünschte Volumen für die Injektion ein (zwischen 9 nl und 50 nl).
- Generieren von Verwundungssteuerungen.
- Füllen Sie die Injektornadel mit sterilem PBS, indem Sie die Spitze der Kapillarnadel vorsichtig in ein Röhrchen mit dem Medium einführen und die "Füllen"-Taste am Injektor drücken.
Anmerkung: Sterile bakterielle Wachstumsmedien können auch als Wundkontrolle verwendet werden, wenn das Experiment die Injektion von Bakterien erfordert, die in ihrem Wachstumsmedium suspendiert sind. Da bakterielle Wachstumsmedien jedoch Komponenten enthalten, die das Immunsystem stimulieren oder andere Auswirkungen auf den Wirt haben können, ist ein inerter Träger wie PBS vorzuziehen.
- Betäuben Sie die gewünschte Anzahl von Fliegen unter einem leichten Strom von Kohlendioxid (CO2).
- Injizieren Sie die Fliegen in den vorderen Bauch auf die ventrolaterale Oberfläche mit dem sterilen PBS.
Anmerkung: Es ist auch möglich, Fliegen an anderen Stellen zu injizieren, wie z. B. an der Sternopleuraplatte des Thorax, aber es ist wichtig, die Injektionsstelle innerhalb jedes Experiments konsistent zu halten.
- Legen Sie die injizierten Fliegen in frische Fläschchen mit einem neuen Medium und legen Sie die Fläschchen auf die Seite, bis sich alle Fliegen von der Narkose erholt haben, um zu verhindern, dass die Fliegen am Futter haften bleiben.
Anmerkung: Es wird empfohlen, die PBS-Kontrollfliegen zu injizieren, bevor Bakterien in Versuchsfliegen injiziert werden, damit für beide Behandlungen dieselbe Nadel verwendet werden kann. Es wird nicht immer möglich sein, die gleiche Nadel für ein ganzes Experiment zu verwenden. In diesem Fall kann es wünschenswert sein, aufzuzeichnen, welche Nadel mit welchen Fliegen verwendet wurde, und die Nadelidentität als experimentellen Faktor in die statistische Analyse einzubeziehen.
- Injizieren Sie den bakteriellen Erreger.
- Werfen Sie das restliche sterile Medium aus dem Injektor aus und füllen Sie dieselbe Nadel erneut mit der Bakteriensuspension.
- Das obige Verfahren (3.1.3) wird wiederholt und nun die in Verfahren 2.2 hergestellte Bakteriensuspension in die Fliegen injiziert.
