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>1. Fliegen sammeln und vorbereiten
- D. melanogaster unter den gewünschten Versuchsbedingungen aufstellen. Achten Sie darauf, die Fliegen während der Aufzucht nicht zu überbevölkern, und stellen Sie sicher, dass die Larvendichten bei allen Behandlungen gleich sind, da die Umweltbedingungen während des Larvenstadiums die Phänotypen der Immunabwehr im Erwachsenenstadium tiefgreifend beeinflussen können.
- Sammeln Sie Versuchsfliegen 0 - 3 Tage nach der Eklosion aus der Puppenhülle und übertragen Sie sie auf frisches Medium.
- Halten Sie die gesammelten Fliegen bei der gewünschten Temperatur (Temperaturen zwischen 22 °C und 28 °C sind in der Regel geeignet), bis sie 5 - 7 Tage nach der Eklosion alt sind.
Anmerkung: Dies gibt den Fliegen genügend Zeit, die Metamorphose abzuschließen und zu reifen Erwachsenen zu werden, ist aber lange bevor die Seneszenz beginnt.
- Sortieren Sie die gewünschte Anzahl von Fliegen vor der Infektion in ein separates Fläschchen und achten Sie auch hier darauf, dass es nicht zu einer Überfüllung kommt.
Anmerkung: In dieser Demonstration werden nur Männchen infiziert, aber es ist ebenso möglich, Weibchen mit dem beschriebenen Verfahren zu infizieren.
>2. Bakterien kultivieren und vorbereiten
- Bereiten Sie mindestens 2 Tage vor der Infektion eine Masterplatte der ausgewählten Bakterien vor. Streichen Sie die Bakterien aus einem 15%igen Glycerinvorrat, der auf unbestimmte Zeit bei -80 °C gelagert wurde. Lagern Sie die Masterplatte bis zu 2 Wochen lang bei 4 °C. Streifen Sie die Masterplatten immer direkt aus dem gefrorenen Glycerinvorrat. Vermeiden Sie die serielle Passage von Bakterien von Platte zu Platte, da eine wiederholte Passage in Kultur dazu führen kann, dass Bakterien eine abgeschwächte Virulenz entwickeln.
Anmerkung: In diesem Beispiel werden Providencia rettgeri und Escherichia coli verwendet.
- Gehen Sie wie folgt vor, um eine bakterielle Suspension für die Injektion vorzubereiten.
- Züchten Sie eine 2-ml-Bakterienkultur, indem Sie ein steriles Medium mit einer einzigen Kolonie beimpfen, die von der Master-Platte isoliert wurde. Züchten Sie die Bakterien in die stationäre Phase (z. B. O/N-Wachstum bei 37 °C).
Anmerkung: Sowohl P. rettgeri als auch E. coli wachsen gut in Luria-Bouillon bei Temperaturen von 20 - 37 °C bei leichtem Schütteln.
- Sobald die Kultur die stationäre Phase erreicht hat, werden die Zellen aus ca. 600 μl der Kultur in einer Tischzentrifuge vorsichtig pelletiert (3 min bei 5.000 x g), der Überstand verworfen und die Bakterien in ca. 1.000 μl steriler, phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2PO4, 1,8 mM KH2PO4, pH = 7,4).
- Verdünnen Sie die resuspendierten Zellen in sterilem PBS, um eine für das verwendete Bakterium geeignete optische Dichte (OD) zu erreichen, die mit einem Spektralphotometer als Extinktion bei 600 nm gemessen wird. Verwenden Sie diese Suspension, um die Fliegen zu infizieren.
Anmerkung: A600 = 0,1 bzw. 1,0 entspricht etwa 10,8 und 10,9 Providencia rettgeri oder E. coli pro ml. Da sowohl lebende als auch tote Bakterien zur optischen Dichte beitragen, ist es wichtig, Kulturen früh in der stationären Phase zu ernten, bevor sich Bakterienkörper ansammeln und das Verhältnis zwischen optischer Dichte und der Anzahl lebensfähiger Bakterien, die während der Infektion eingeführt werden, verzerren.
>3. Infizieren Sie die Fliegen
HINWEIS: Da die Immunität von Drosophila durch den zirkadianen Rhythmus beeinflusst wird, ist es wichtig, Infektionen zu einer ähnlichen Tageszeit bei experimentellen Replikaten durchzuführen.
- Mit septischem Nadelstich
- Bereite die Nadel für das Einstechen vor.
- Schmelzen Sie das Ende einer 200 μl Mikropipettenspitze und führen Sie einen 0,15 mm Insekten-Minutienstift in den geschmolzenen Kunststoff ein. Lassen Sie den Kunststoff so erstarren, dass der Stift an Ort und Stelle gehalten wird, wobei etwa 0,5 cm des Stifts aus dem Kunststoff herausragen.
- Generieren von Verwundungssteuerungen.
- Betäuben Sie die gewünschte Anzahl von Fliegen bei leichtem CO2 -Strom.
- Stechen Sie die Fliegen mit der Nadel in die sternopleurale Platte des Thorax und vermeiden Sie dabei die Befestigungsstellen der Flügel und der Beine. Entfernen Sie bei Bedarf vorsichtig Fliegen mit einer weichen Pinzette aus dem winutien-Stift.
Anmerkung: Es ist auch möglich, die Fliegen an anderen Stellen zu stechen, wie z. B. am vorderen Bauch auf der ventrolateralen Fläche, aber es ist wichtig, die Injektionsstelle innerhalb jedes Experiments konsistent zu halten. Das Einstechen durch die Nagelhaut des Bauches ist tendenziell schwieriger als das Einstechen in den Brustkorb und kommt daher seltener vor.
- Legen Sie die gestochenen Fliegen in ein frisches Fläschchen mit einem neuen Fliegenmedium und legen Sie das Fläschchen auf die Seite, bis sich alle Fliegen von der Narkose erholt haben, um zu verhindern, dass die Fliegen am Futter kleben bleiben.
- Führen Sie die bakterielle Infektion ein.
- Betäuben Sie die gewünschte Anzahl von Fliegen bei leichtem CO2 -Strom.
- Stechen Sie jede Fliege an der gleichen Stelle wie die Kontrollen des Mediums ein, indem Sie die Spitze der Nadel in die in Verfahren 2.2 hergestellte Bakteriensuspension tauchen, bevor Sie jede Fliege einstechen.
- Legen Sie die gestochenen Fliegen in ein frisches Fläschchen mit einem neuen Fliegenmedium und legen Sie das Fläschchen auf die Seite, bis sich alle Fliegen von der Narkose erholt haben, um zu verhindern, dass die Fliegen am Futter kleben bleiben.