Messung der bakteriellen Belastung von E. coli in Drosophila melanogaster nach einer E. coli-Infektion

Zusammenfassung

Quelle: Khalil, S., et al. Systemische bakterielle Infektionen und Immunabwehr-Phänotypen bei Drosophila melanogaster. J. Vis. (2015)

In diesem Video demonstrieren wir eine Technik zur Messung der bakteriellen Belastung von E. coli nach der Injektion von E. coli in den Thorax von Drosophila melanogaster.

Protokoll

>1. Assay der bakteriellen Last nach der Infektion

1. Messen Sie die Bakterienbelastung.
   1. Legen Sie jede Fliege zu einem vorgeschriebenen Zeitpunkt nach der Injektion in ein Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis.
   2. Geben Sie 250 μl PBS in jedes Röhrchen und homogenisieren Sie die Fliegen entweder mit einem Stößel oder einem Rührbesen.
   3. Das Homogenat wird auf einer LB-Agarplatte plattiert, entweder mit einem Spiralplattenteller oder einer seriellen Verdünnung.
      1. Auf die Platte mit serieller Verdünnung übertragen Sie jedes Fliegenhomogenat in die erste Reihe einer 96-Well-Platte.
      2. Füllen Sie jede Vertiefung der verbleibenden Reihen mit 90 μl PBS.
      3. Mit einer Mehrkanalpipette werden 10 μl aus der ersten Reihe mit dem Fliegenhomogenat entnommen und in die zweite Reihe abgegeben.
      4. Pipettieren Sie mindestens 10 Mal auf und ab, um gründlich zu mischen, und nehmen Sie dann 10 μl und geben Sie es in die dritte Reihe. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit den verbleibenden Zeilen.
      5. Beginnend in der untersten Reihe (die meisten verdünnten Bakteriensuspensionen) entnehmen Sie mit der Mehrkanalpipette 10 μl aus jeder Vertiefung und legen Sie sie auf eine LB-Platte, wobei Sie darauf achten, dass die Proben als diskrete Spots ausgegeben werden, die sich nicht berühren. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Vertiefungen aus jeder Reihe beprobt wurden, und geben Sie sie in absteigender Reihenfolge der Verdünnung auf die LB-Platte.
      6. Lassen Sie die Platte bei RT, bis die Flecken vollständig in die LB-Platte eingedrungen sind.
         Anmerkung: Es wird empfohlen, die LB-Platte vor der Verwendung einige Tage lang bei RT zu trocknen, um sicherzustellen, dass die Flüssigkeit leicht aufgenommen wird und die Wahrscheinlichkeit eines versehentlichen Kontakts zwischen den Probenflecken minimiert wird.
   4. Inkubieren Sie die Platten O/N und achten Sie darauf, dass die Platten nicht überwachsen, damit die Kolonien klein und diskret bleiben.
      Anmerkung: Abhängig vom verwendeten bakteriellen Wachstumsmedium und der verwendeten Inkubationstemperatur können schließlich Kolonien auf der Platte erscheinen, die von der endogenen Darmmikrobiota der Fliege abstammen. Die meisten Bakterien, die für pathogene Infektionen verwendet werden, wachsen jedoch bei 37 °C viel schneller als die Darmmikrobiota auf LB-Agar.
   5. Entfernen Sie die Platten aus dem Inkubator, wenn die experimentellen Bakterien sichtbare Kolonien gebildet haben (typischerweise 8 - 12 Stunden), aber bevor Drosophila-Darmmikrobiota-Kolonien erscheinen (ca. 36 Stunden). Bei langsam wachsenden experimentellen Bakterien verwenden Sie ein selektives Antibiotikum im LB-Agar, um alle Kolonien aus der Darmmikrobiota zu entfernen.
   6. Zählen Sie die Anzahl der Kolonien für jedes Homogenat.
      1. Bei Spiralplatten zählen Sie die wachsenden Kolonien mit einem automatischen Koloniezähler, der die Bakterienlast pro ml Homogenat basierend auf der Anzahl und Position der Kolonien auf der Platte schätzen kann.
         HINWEIS: Spiralzählungen sind am genauesten, wenn die Bakterienkonzentration im Bereich von 5 x 10² bis 5 x 10⁴ Bakterien pro ml liegt.
      2. Zählen Sie bei Spotplatten manuell die Kolonien für jede Fliege aus der Verdünnung, die 30 - 300 Kolonien enthält, und berechnen Sie die Anzahl der Bakterien pro ml des ursprünglichen Homogenats.
2. Analysieren Sie die Daten.
   1. Wenn die Bakterienlast nicht normal ist, transformieren Sie die Daten entweder, um eine Normalverteilung besser zu approximieren, oder analysieren Sie die Daten mit nicht-parametrischer statistischer Analyse (z. B. Mann-Whitney-U-Test). Verwenden Sie eine Box-Cox-Analyse, um die optimale Transformation zu finden. Natürliche Logarithmus- oder Base-10-Log-Transformationen sind häufig effektiv.
   2. Wenn die Daten ausreichend normalverteilt sind und nur zwei Behandlungen gegenübergestellt werden, führen Sie einen t-Test durch, um festzustellen, ob die beiden Behandlungen zu unterschiedlichen mittleren Bakterienlasten führen. Wenn es mehrere experimentelle Variablen oder andere potenziell prädiktive Faktoren gibt, verwenden Sie die Varianzanalyse (ANOVA), um zu bestimmen, welche Faktoren signifikante Prädiktoren für die Bakterienlast sind.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Petrischalen mit klarem Deckel, erhöhter Grat; 100 x 15 mm;	VWR Deutschland	Tel.: 25384-302
LB Agar, Müller	Difco	Artikel-Nr.: 244520
IMPFÖSE	VWR Deutschland	Tel.: 80094-488
1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen; Siegel-Ritus	USA Scientific Inc.	Tel.: 1615-5500
Motorisierter Stößel; Talboys Laborrührer	Troemner	Nr. 103
Talboys Homogenisator mit hohem Durchsatz	OPS-Diagnose	930145
5/32'' Schleifkugeln	OPS-Diagnose	GBSS 156-5000-01
Vortex Genie	Wissenschaftliche Industrie AG	G560
Mehrkanal-Pipettierer (10 μl-300 μl)	Schneidermuskel	Artikel-Nr.: 730360
WASP2 Whitley Automatisierter Spiralplattenteller	Mikrobiologie International
ProtoCOL automatisierter Koloniezähler / Plattenzähler / Plattenleser	Mikrobiologie International
Brutkasten	Powers Scientific, Inc	DROS52SD