Assay zur Bestimmung der infektiösen Virusdosis des Drosophila-C-Virus in kultivierten Insektenzellen

Zusammenfassung

Quelle: Yang, S. et al., Etablierung einer Virusinfektion und Analyse der Wirt-Virus-Interaktion bei Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (2019)

In diesem Video demonstrieren wir den zytopathischen Wirkungsassay zur Bestimmung der infektiösen Virusdosis des Drosophila C-Virus in Gewebekulturen auf Drosophila S2*-Zellen. Eine Reihe von Viruskonzentrationen wird verwendet, um die kultivierten Zellen zu infizieren. Es wird der Anteil der Zellen bestimmt, die strukturelle Veränderungen aufweisen, und diese Daten werden zur Berechnung der infektiösen Dosis der Gewebekultur verwendet.

Protokoll

>1. Messung der Drosophila-C-Viruslast durch CPE-Assay

1. Entnehmen Sie 5 zufällige virushaltige Röhrchen, um die durchschnittliche infektiöse Dosis der Virusgewebekultur (TCID₅₀) durch einen CPE-Assay (Cytopathic Effect) zu bestimmen (1 Einheit TCID₅₀ = 0,7 Plaque-bildende Einheit [PFU]).
   Anmerkung: CPE bezieht sich auf strukturelle Veränderungen in Wirtszellen, die durch eine Virusinvasion verursacht werden. Das infizierende Virus verursacht die Lyse der Wirtszelle oder wenn die Zelle ohne Lyse stirbt, weil sie sich nicht vermehren kann.
2. Sammeln Sie an Tag 1 präparierte S2*-Zellen durch Pipettieren. Zählen Sie die Handynummer. Die Zellen für 300 x g für 4 min zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Verdünnen Sie die Zellen auf eine Dichte von 1 x 10⁶ Zellen/ml mit einem vollständigen Medium für S2*-Zellen.
3. 1 x 10⁵ S2*-Zellen (100 μl) pro Well auf die 96-Well-Platte mit flachem Boden (~30 % Konfluenz) ausstechen.
4. Führen Sie serielle 10-fache Verdünnungen des DCV-Stammes mit vollständigem Medium für S2*-Zellen durch. 50 μl Verdünnungen in die Vertiefung geben. 50 μl Kulturmedium ohne Viren werden in die Vertiefung gegeben, die als Negativkontrollvertiefung eingestuft ist.
   Anmerkung: Für jede Verdünnungsrate wurden 8 Wells verwendet. Da die typische DCV-Ausbeute bei etwa 10^{8-10 9} PFU/ml liegt, sollte die Verdünnung mindestens ~10-5-10-10 betragen.
5. Beobachten Sie CPE an Tag 4 mit einem Hellfeldmikroskop mit einem 20X- oder 40X-Objektiv. Klassifizieren Sie eine Vertiefung, in der die Zellen verschwommen aussehen und das Medium voller Fragmente ist, als "positive Vertiefung", und eine Vertiefung, in der die Zellmorphologie normal ist, als "negative Vertiefung".
6. Markieren Sie CPE-positive oder -negative Wells mit + bzw. –. Berechnen Sie den Virus TCID₅₀ nach der Reed-und-Muench-Methode.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen	Marke	Artikel-Nr.: 352070
10 cm Zellkulturschale	Sigma	CLS430167	Zellkultur
Zell-Inkubator	Sanyo	MIR-553
Zentrifuge	Eppendorf	5810R
Zentrifuge	Eppendorf	5424R
Drosophila-Brutkasten	Percival	I-41NL	Aufzucht von Drosophila
FBS	Invitrogen	Artikel-Nr.: 12657-029	Zellkultur
Schneiders Insektenmedium	Sigma	Nr. S9895	Zellkultur
Statistische Software	GraphPad Prism 7
96-Well-Platte mit flachem Boden	Sigma	CLS3922	Zellkultur
Zell-Inkubator	Sanyo	MIR-553
Mikroskop	Olymp	CKX41