Nachweis der Inflammasomaktivierung mittels Fluoreszenzmikroskopie

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Entnahme von Knochenmark

1. Entfernen Sie aseptisch den Oberschenkelknochen und das Schienbein von einer Maus und reinigen Sie die Knochen mit sterilen Instrumenten. Legen Sie die gereinigten Knochen in Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) + 5 mM N-2-hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure (HEPES) + 0,2 mg/ml L-Glutamin + 0,05 mM 2-Mercaptoethanol + 50 mg/ml Gentamicinsulfat + 10.000 U/ml Penicillin/Streptomycin + 10% fötales Rinderserum (FBS, DMEM-10 vollständig) und inkubieren Sie das Röhrchen 15 Minuten lang auf Eis.
2. Entfernen Sie die proximalen und distalen Kugelgelenke mit einer Schere. Führen Sie eine 25-g-Nadel, die an einer mit Medium gefüllten 10-ml-Spritze befestigt ist, in die Vertiefung der Knochen ein. Spülen Sie das Knochenmark mit DMEM-10 complete aus. Suspendieren Sie alle Klumpen, indem Sie das Medium vorsichtig auf und ab pipettieren.
3. Zentrifugieren Sie die Zellen 10 Minuten lang bei 300 x g und zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einem Hämozytometer. Zu diesem Zeitpunkt frieren Sie die Zellen entweder mit 90 % FBS + 10 % Dimethylsulfoxid (DMSO) ein oder plattieren Sie die Zellen in einer 15 cm großen Petrischale, um Makrophagen mit L929-konditioniertem Medium zu unterscheiden (Schritt 2.1).

>2. Differenzierung von Makrophagen aus dem Knochenmark

1. Unter Verwendung eines vorgewärmten Differenzierungsmediums (21 mL DMEM-10 vollständig und 9 mL L929 zellkonditioniertes Medium, wie von Swanson et al. beschrieben) geben Sie Knochenmarkzellen in eine 15 cm große, nicht mit Gewebekulturen behandelte Petrischale (1,2-1,5 x 10⁷ Zellen). Inkubieren Sie die Platte 7 Tage lang bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid oder CO₂. Geben Sie an Tag 3 oder 4 weitere 30 ml Differenzierungsmedium in die Platte.
   Anmerkung: Es ist wichtig, keine mit Gewebekulturen behandelten Platten zu verwenden, da Makrophagen nur schwer abzulösen und zu entnehmen sind.
2. Um Makrophagen zu sammeln, waschen Sie die Platte mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und fügen Sie 20 ml kaltes PBS + 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) hinzu. Die Platte bei 4 °C 10 min inkubieren. Ernten Sie die Zellen, indem Sie das PBS + EDTA über die Zellen pipettieren und die Platte mit 10 mL PBS waschen. Kombinieren Sie beide Waschungen in zwei konische 15-ml-Röhrchen.
3. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 10 min und resuspendieren Sie die Zellen in 10 mL phenolrotfreiem DMEM + 5 mM HEPES + 0,2 mg/mL L-Glutamin + 0,05 mM 2-Mercaptoethanol + 5% FBS (DMEM-5) und zählen Sie die Zellen entweder mit einem Hämozytometer oder einem Coulter-Zähler. Halten Sie die Zellen während der Zählung auf Eis.
4. Die Makrophagen werden in mit Gewebekulturen beschichteten Platten mit 2 x 10⁵ Zellen/ml ausgesät. Für Mikroskopie-Experimente säen Sie 1 ml Zellen auf Deckgläsern in 24-Well-Platten. Für Lactatdehydrogenase (LDH)-Freisetzungsassays säen Sie 100 μl Zellen in einer 96-Well-Platte aus. Für den LDH-Assay säen Sie 9 Vertiefungen aus (3 Vertiefungen unbehandelt, 3 Vertiefungen mit 100 % Lysekontrollen und 3 Vertiefungen für den experimentellen Stimulus).
5. Zentrifugieren Sie die 96-Well-Platte 5 Minuten lang bei 300 x g, um sicherzustellen, dass die Zellen gleichmäßig über die Vertiefung verteilt sind.
6. Die Platte über Nacht bei 37 °C + 5 % CO₂ inkubieren, bevor der Grundierungsprozess gestartet wird.

>3. Grundierung

1. Ersetzen Sie das Medium durch frisches Medium (DMEM-5) mit 100 ng/ml Lipopolysaccharid oder LPS (500 μl für die 24-Well-Platte oder 50 μl für die 96-Well-Platte).
   Anmerkung: Es gibt eine Vielzahl von strukturellen Variationen bei LPS, die die Fähigkeit zur Stimulation des TLR4-vermittelten Primings beeinträchtigen. LPS aus Salmonella minnesota R595 (Re) ist von mehreren Anbietern erhältlich und wird empfohlen.
2. Die Platte 3 h bei 37 °C und 5 % CO₂ inkubieren.

>4. Aktivierung des NLRP3 Inflammasoms mit Nigericin und Markierung mit FAM-YVAD-FMK

1. Entfernen Sie das Medium und ersetzen Sie es durch 290 μl DMEM-5, das 5 μM Nigericin und 5 mM Glycin enthält. Glycin wird hinzugefügt, um die Menge an Zelllyse zu reduzieren, die während der Caspase-1-Aktivierung auftritt. 60 min bei 37 °C und 5 % CO₂ inkubieren. Verwenden Sie sowohl Wildtyp- als auch Caspase-1-defiziente Makrophagen, um sicherzustellen, dass die beobachtete Markierung spezifisch für Caspase-1 ist.
2. Während der letzten 45 Minuten 10 μl 30x FAM-YVAD-FMK zugeben, hergestellt nach Herstellerangaben.
3. Entfernen Sie nach 60 min das Medium und waschen Sie die Zellen dreimal für jeweils 5 min mit 1 mL kaltem PBS.
4. Geben Sie 250 μl 2% Paraformaldehyd in jede Vertiefung und inkubieren Sie 30 Minuten lang auf Eis, das mit Aluminiumfolie bedeckt ist.
5. Fügen Sie während der letzten 5 Minuten 4 μl 0,2 mM dunkelrot fluoreszierenden Nukleinsäurefärbemittel hinzu, um die Zellkerne zu markieren. 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) oder andere Farbstoffe können ebenfalls zur Markierung von DNA verwendet werden.
6. Waschen Sie die Zellen dreimal mit 1 mL kaltem PBS und befestigen Sie die Deckgläser mit einem 7 μl Anti-Fade-Eindeckmedium auf Objektträger. Lassen Sie das Eindeckmedium über Nacht aushärten, bevor Sie das Deckglas mit Nagellack am Objektträger versiegeln.
7. Abbildung der Makrophagen durch konfokale Mikroskopie. Ex/Em für FAM-YVAD-FMK ist 492/520nm und 642/661 für dunkelrot fluoreszierende Nukleinsäurefärbung. Stellen Sie sicher, dass Sie das Mikroskop so aufstellen, dass unbehandelte Zellen keine Hintergrundfärbung im 488-Kanal aufweisen. Andernfalls wird eine Hintergrundfärbung von FAM-YVAD-FMK erkannt und keine tatsächliche aktive Caspase-1.

>5. Bildgebung von markierten Makrophagen durch konfokale Mikroskopie

HINWEIS: Die gefärbten Zellen können betrachtet werden, nachdem die Deckgläser über Nacht ausgehärtet und mit Nagellack auf dem Objektträger versiegelt wurden. Hier wird die Bildgebung mit einem konfokalen Mikroskop beschrieben. Zellen können auch mit der Standard-Fluoreszenzmikroskopie betrachtet werden.

1. Legen Sie den Objektträger mit den unbehandelten Kontrollzellen auf den Mikroskoptisch und fokussieren Sie das Mikroskop auf die Zellen.
2. Passen Sie den Offset mithilfe der LUT-Einstellungen (Look Up Table) des Mikroskops so an, dass in den unbehandelten Zellen keine positive FAM-YVAD-FMK-Färbung vorhanden ist. Dieser Prozess kann auch mit Caspase-1-defizienten Makrophagen durchgeführt werden.
   Anmerkung: Der Offset muss für jeden im Experiment verwendeten Kanal angepasst werden, aber die Einstellung des richtigen Offsets ist für den FAM-YVAD-FMK-Kanal und die fluoreszierenden Antikörperkanäle am wichtigsten. Der Offset für den DNA-Kanal ist weniger kritisch. Nachdem Sie den Versatz eingestellt haben, passen Sie diese Einstellung für den Rest des Experiments nicht mehr an.
3. Schalten Sie den Objektträger auf die mit Nigericin behandelte Probe um. Suchen Sie ein Feld, das sowohl positive als auch negative Zellen für die FAM-YVAD-FMK-Färbung enthält. Stellen Sie die Bildgebungsebene des FAM-YVAD-FMK-Kanals auf die Ebene mit der höchsten Intensität der positiven Färbung ein. Dies ist normalerweise die Ebene, in der das Zentrum des Inflammasom-Fokus abgebildet wird.
4. Passen Sie die Verstärkung so an, dass in Zellen mit kondensierten Zellkernen Herde sichtbar sind. Nachdem Sie sowohl Verstärkung als auch Offset eingestellt haben, behalten Sie diese Einstellungen für den Rest der Bildgebungssitzung bei.
   Anmerkung: Eine einfache Möglichkeit, um festzustellen, ob eine Zelle pyroptotisch ist, besteht darin, sich die Kernmorphologie anzusehen. Zellen mit aktiver Caspase-1 haben abgerundete und kondensierte Zellkerne, während Nukleolen in Zellen ohne Caspase-1-Aktivierung sichtbar sind und die Kernmorphologie der von unbehandelten Zellen ähnelt.
5. Sammeln Sie Bilder von 5 zufällig ausgewählten Feldern mit 100-facher Gesamtvergrößerung. Dies ergibt in der Regel etwa 40 Zellen pro Bild. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede Probe.
6. Zählen Sie die Anzahl der Zellen in jedem Bild mit Hilfe einer Bildanalysesoftware. Zählen Sie dann die Anzahl der Zellen, die eine positive FAM-YVAD-FMK-Färbung aufweisen. Stellt den Grad der Caspase-1-Aktivierung als Prozentsatz der FAM-YVAD-FMK-positiven Zellen dar.