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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
1. Differenzierung von Makrophagen aus dem Knochenmark
- Unter Verwendung eines vorgewärmten Differenzierungsmediums (21 mL DMEM-10 vollständig und 9 mL L929 zellkonditioniertes Medium, wie von Swanson et al. beschrieben) geben Sie Knochenmarkzellen in eine 15 cm große, nicht mit Gewebekulturen behandelte Petrischale (1,2-1,5 x 107 Zellen). Inkubieren Sie die Platte 7 Tage lang bei 37 °C und 5 % CO2. Geben Sie an Tag 3 oder 4.
weitere 30 ml Differenzierungsmedium in die Platte
Anmerkung: Es ist wichtig, keine mit Gewebekulturen behandelten Platten zu verwenden, da Makrophagen nur schwer abzulösen und zu entnehmen sind.
- Um Makrophagen zu sammeln, waschen Sie die Platte mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und fügen Sie 20 ml kaltes PBS + 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) hinzu. Die Platte bei 4 °C 10 min inkubieren. Ernten Sie die Zellen, indem Sie das PBS + EDTA über die Zellen pipettieren und die Platte mit 10 mL PBS waschen. Kombinieren Sie beide Waschungen in zwei konische 15-ml-Röhrchen.
- Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 10 min und resuspendieren Sie die Zellen in 10 mL phenolrotfreiem DMEM + 5 mM HEPES + 0,2 mg/mL L-Glutamin + 0,05 mM 2-Mercaptoethanol + 5% FBS (DMEM-5) und zählen Sie die Zellen entweder mit einem Hämozytometer oder einem Coulter-Zähler. Halten Sie die Zellen während der Zählung auf Eis.
- Die Makrophagen werden in mit Gewebekulturen beschichteten Platten mit 2 x 105 Zellen/ml ausgesät. Für Mikroskopie-Experimente säen Sie 1 ml Zellen auf Deckgläsern in 24-Well-Platten. Für LDH-Freisetzungsassays säen Sie 100 μl Zellen in einer 96-Well-Platte. Für den LDH-Assay säen Sie 9 Vertiefungen aus (3 Vertiefungen unbehandelt, 3 Vertiefungen mit 100 % Lysekontrollen und 3 Vertiefungen für den experimentellen Stimulus).
- Zentrifugieren Sie die 96-Well-Platte 5 Minuten lang bei 300 x g, um sicherzustellen, dass die Zellen gleichmäßig über die Vertiefung verteilt sind.
- Die Platte über Nacht bei 37 °C + 5 % CO2 inkubieren, bevor der Grundierungsprozess gestartet wird.
>2. Grundierung
- Ersetzen Sie das Medium durch ein frisches Medium (DMEM-5) mit 100 ng/ml LPS (500 μl für die 24-Well-Platte oder 50 μl für die 96-Well-Platte).
Anmerkung: Es gibt eine Vielzahl von strukturellen Variationen bei LPS, die die Fähigkeit zur Stimulation des TLR4-vermittelten Primings beeinträchtigen. LPS aus Salmonella minnesota R595 (Re) ist von mehreren Anbietern erhältlich und wird empfohlen.
- Die Platte 3 h bei 37 °C und 5 % CO2 inkubieren.
>3. Aktivierung des NLRP3-Inflammasoms mit Nigericin
- Entfernen Sie das Medium und ersetzen Sie es durch 290 μl DMEM-5, das 5 μM Nigericin und 5 mM Glycin enthält. Glycin wird hinzugefügt, um die Menge an Zelllyse zu reduzieren, die während der Caspase-1-Aktivierung auftritt. 60 min bei 37 °C und 5 % CO2 inkubieren. Verwenden Sie sowohl Wildtyp- als auch Caspase-1-defiziente Makrophagen, um sicherzustellen, dass die beobachtete Markierung spezifisch für Caspase-1 ist.
- Entfernen Sie nach 60 min das Medium und waschen Sie die Zellen dreimal für jeweils 5 min mit 1 mL kaltem PBS.
>4. Antikörper-Färbung
HINWEIS: Um die Zellen mit Antikörpern zu markieren, um ASC zu erkennen, zu säen, zu primen und die Zellen Nigericin auszusetzen, identisch mit dem vorherigen Abschnitt. Die anschließende Verarbeitung ist wie folgt:
- Waschen Sie die Zellen dreimal für jeweils 5 Minuten mit 1 mL kaltem PBS. Fügen Sie 250 μl Fixierungs- und Permeabilisierungslösung hinzu. Inkubieren Sie die Zellen auf Eis und decken Sie sie 30 Minuten lang ab.
- Waschen Sie die Makrophagen dreimal für jeweils 5 min mit 1 mL Waschpuffer.
- 250 μl Primärantikörper gegen ASC, verdünnt 1:500 in Waschpuffer, zugeben und 1 h auf Eis inkubieren. Fügen Sie ein Deckglas bei, das keinen primären Antikörper erhält, sondern nur den sekundären Antikörper erhält. Dieses Deckglas wird während der Einrichtung des Mikroskops verwendet, um den richtigen Versatz einzustellen.
- Waschen Sie die Zellen dreimal für jeweils 5 min mit 1 mL Waschpuffer.
- 250 μl Sekundärantikörper (Fluoreszenzfarbstoff, konjugierter Ziegen-Anti-Maus-Antikörper), verdünnt 1:500 in Waschpuffer, zugeben und 1 h auf Eis inkubieren. Geben Sie für die letzten 5 Minuten dieser Inkubation 4 μl 0,2 mM dunkelrot fluoreszierende Nukleinsäurefärbung zur Markierung der Zellkerne.
- Waschen Sie die Zellen 3x mit 1 mL Kaltwaschpuffer und befestigen Sie die Deckgläser mit einem 7 μl Anti-Fade-Eindeckmedium auf Objektträger. Lassen Sie das Eindeckmedium über Nacht aushärten, bevor Sie das Deckglas mit klarem Nagellack auf dem Objektträger versiegeln.
- Abbildung von Makrophagen durch konfokale Mikroskopie. Ex/Em für den Sekundärantikörper beträgt 555/580 nm und 642/661 für die dunkelrot fluoreszierende Nukleinsäurefärbung.