Ein Laktat-Dehydrogenase-Freisetzungsassay zum Nachweis des Todes von Makrophagen nach Nigericin-Exposition

Zusammenfassung

Quelle: den Hartigh, A.B. et al., Nachweis der Inflammasomaktivierung und des pyroptotischen Zelltods in maurinen Knochenmark-abgeleiteten Makrophagen. J. Vis. Exp. (2018)

Dieses Video zeigt den Laktat-Dehydrogenase-Assay zum Nachweis des Inflammasom-vermittelten Makrophagen-Todes. Die Makrophagen werden zum Priming Lipopolysaccharid ausgesetzt, gefolgt von einer Exposition gegenüber Nigericin, um einen Inflammasom-induzierten Zelltod zu verursachen, der durch den Laktatdehydrogenase-Assay bestimmt wird.

Protokoll

>1. LDH-Freigabe-Assay

HINWEIS: Für den LDH-Freisetzungsassay säen Sie die Zellen in eine 96-Well-Platte. Entfernen Sie das Medium nach dem Grundieren nicht.

1. Ersetzen Sie das Medium durch frisches Medium (DMEM-5: 10 mL phenolrotfreies DMEM + 5 mM HEPES + 0,2 mg/mL L-Glutamin + 0,05 mM 2-Mercaptoethanol + 5 % FBS) mit 100 ng/ml LPS in Wells mit adhärenten Makrophagenzellen (500 μL für die 24-Well-Platten oder 50 μL für die 96-Well-Platten).
   Anmerkung: Es gibt eine Vielzahl von strukturellen Variationen bei LPS, die die Fähigkeit zur Stimulation des TLR4-vermittelten Primings beeinträchtigen. LPS aus Salmonella minnesota R595 (Re) wird empfohlen.
2. Die Platte 3 h bei 37 °C und 5 % CO₂ inkubieren.
3. 50 μl DMEM-5 mit 10 μM Nigericin in die Versuchsvertiefungen und 50 μl DMEM-5 in die spontanen und 100 % Lysekontrollvertiefungen geben. 60 min bei 37 °C und 5 % CO₂ inkubieren.
4. Geben Sie nach 30 Minuten 10 μl 10x Lysepuffer in die 100%-Lysekontrollvertiefungen und fügen Sie 10 μl DMEM-5 in die anderen Vertiefungen hinzu. Während dieser Inkubation 1 Fläschchen mit Substratmischung (1,5 mL gefriergetrocknetes Substrat) und 1 Aliquot Assay-Puffer (~12 mL) aus dem Gefrierschrank nehmen und lichtgeschützt auf Raumtemperatur auftauen lassen.
   Anmerkung: Die Substratmischung enthält ein Tetrazoliumsalz (Jodnitrotetrazoliumviolett), das in ein rotes Formazanprodukt umgewandelt wird.
5. Nach der Gesamtinkubation von 60 Minuten wird die Platte 5 Minuten lang bei 500 x g bei 10 °C zentrifugiert. 50 μl des Überstands werden auf eine durchsichtige Platte mit flachem Boden übertragen. Während dieser Zeit 12 ml Assay-Puffer in das Fläschchen mit der Substratmischung geben und vor der Verwendung 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
6. Geben Sie 50 μl Substrat in jede Vertiefung und inkubieren Sie 30 Minuten lang im Dunkeln. Schließen Sie nur mittlere Vertiefungen für leere Werte ein. Überprüfen Sie die Platte nach 15 Minuten, um sicherzustellen, dass das Signal die Nachweisgrenze des Plattenlesers nicht überschreitet.
7. Nach 30 min 50 μl Stopplösung (1 M Essigsäure) zugeben und OD₄₉₀ mit einem Plattenlesegerät messen.
8. Berechnen Sie den Prozentsatz der Zelllyse mit der folgenden Formel:
   % Zytotoxizität = ((Experimentell - Spontan)/(Maximum - Spontan))×100
   Experimentell: mit Nigericin behandelte Zellen; spontan: unbehandelte Zellen; Maximum: Zellen, die Lysepuffer ausgesetzt sind.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Cytotox96 Assay für nicht-radioaktive Zytotoxizität	Fisher Scientific	PR-G1780	Enthält Substratmischung und Assay-Puffer; Proprietäre Formulierungen. Stopplösung ist 1 M Essigsäure
DMEM, hoher Glukosegehalt, kein Glutamin, kein Phenolrot	Invitrogen	31053028
Dulbecco's PBS, kein Calcium, kein Magnesium	Invitrogen	14190144
Fötales Rinderserum, qualifiziert, US-Herkunft	Invitrogen	26140079	50 min lang bei 55°C hitzeinaktiviert
gentamicin	Invitrogen	15750060
Hochreines LPS aus Salmonella minnesota R595 (Re)	Liste Biologika	Nr. 434
Spectramax M3 Plattenleser	Molekulare Bauelemente	5000414
L-Glutamin	Invitrogen	21051024