Induktion und Visualisierung von extrazellulären Fallen von Neutrophilen in vormarkierten Neutrophilen

Zusammenfassung

Quelle: Arends, E. J. et al., Ein Hochdurchsatz-Assay zur Beurteilung und Quantifizierung der extrazellulären Fallenbildung von Neutrophilen.J. Vis. Exp.(2019)

Dieses Video zeigt die Induktion und Visualisierung von extrazellulären Neutrophilen-Fallen oder NETs in vormarkierten Neutrophilen unter Verwendung von Patientenserum, das zytoplasmatische Antikörper gegen Neutrophile enthält. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung eines undurchlässigen DNA-Farbstoffs und der Fluoreszenzmikroskopie die Visualisierung von NETs.

Protokoll

Alle Eingriffe mit menschlichen Teilnehmern wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für das Wohlergehen des Menschen durchgeführt und vom lokalen institutionellen Prüfungsausschuss überprüft.

>1. Isolierung gesunder Neutrophiler

1. Entnehmen Sie 20 ml peripheres Blut von einem gesunden Spender in zwei 10 ml mit Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) beschichteten Röhrchen.
2. Geben Sie 10 ml Blut in ein steriles 50-ml-Röhrchen und fügen Sie phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) bis zu 32,5 ml hinzu.
3. Fügen Sie einen Dichtegradienten (z. B. Ficoll-amidotrizoaat) unter den Zellen hinzu.
   1. Nehmen Sie einen Dichtegradienten von 14 mL mit einer 10-ml-Pipette und einer Pipettiersteuerung auf.
   2. Legen Sie die Pipette auf den Boden des 50-ml-Röhrchens.
   3. Nehmen Sie die Pipettiersteuerung von der Pipette ab und lassen Sie den Dichtegradienten durch die Schwerkraft aus der Pipette fließen, bis das Maximum durch Kapillarwirkung erreicht ist (1-2 mL bleiben übrig), ohne den Motor zu verwenden.
   4. Entfernen Sie die Pipette, indem Sie einen Daumen auf die Pipette legen, um zu verhindern, dass der Dichtegradient beim Entfernen der Pipette austritt.
4. Die Röhren 20 min lang bei 912 x g und Raumtemperatur (RT) ohne Beschleunigung und Bremse drehen.
   HINWEIS: Rote Blutkörperchen (RBC) und Neutrophile haben eine hohe Dichte und befinden sich am Boden des 50-ml-Röhrchens. Mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) werden getrennt und liegen als weißer Ring auf dem Dichtegradienten. PBS-verdünntes Plasma liegt über den PBMCs. Bei Bedarf können PBMCs isoliert werden, indem der weiße Ring in ein neues 50-ml-Röhrchen mit zusätzlichen Waschschritten mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) übertragen wird.
5. Entfernen Sie vorsichtig zuerst den weißen Ring mit PBMCs, dann entfernen Sie das PBS-verdünnte Plasma und schließlich die Dichtegradientenschicht so weit wie möglich.
6. Um Neutrophile aus der Mischung aus Neutrophilen/Erythrozyten zu isolieren, lysieren Sie die Erythrozyten mit kaltem, sterilem destilliertem Wasser.
   1. Nehmen Sie eine kalte, sterile Flasche destilliertes Wasser und eine 10x konzentrierte PBS-Flasche aus dem Kühlschrank.
   2. Arbeiten Sie schnell für diesen Schritt. Geben Sie 36 ml kaltes, steriles destilliertes Wasser direkt auf das Pellet und mischen Sie es einmal vorsichtig. Fügen Sie nach 20 s 4 mL 10x PBS hinzu, um eine isotonische Lösung herzustellen. Einmal vorsichtig mischen.
   3. Das Röhrchen 5 min bei 739 x g und 4 °C (zur Entfernung von Erythrozyten) drehen. Neutrophile befinden sich in der weißen Kugel.
   4. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig. Führen Sie Schritt 1.6.2 erneut durch und stellen Sie sicher, dass das Pellet richtig aufgehängt ist.
   5. Röhrchen 5 min bei 328 x g und 4 °C schleudern.
   6. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 5 mL PBS. Zählen Sie die Neutrophilen und halten Sie sie auf Eis.
      HINWEIS: Die erwartete Ausbeute von 1 Röhrchen Blut (10 ml) beträgt ca. 15-75 Millionen Neutrophile.

>2. Rot fluoreszierende Zellmarkierung von Neutrophilen

1. Stellen Sie eine Neutrophilensuspension von 10-20 Millionen Neutrophilen in 2 ml PBS in einem 15 ml-Röhrchen her.
2. Stellen Sie eine Lösung aus 2 mL PBS mit 4 μL 2 μM rot fluoreszierendem Zelllinker (siehe Materialtabelle) in einem anderen 15 mL Röhrchen her. Geben Sie dies vorsichtig in die neutrophile Suspension und mischen Sie es vorsichtig.
3. Inkubieren Sie im Dunkeln für genau 25 Minuten bei 37 °C, um die Neutrophilen mit dem rot fluoreszierenden Zelllinker zu markieren.
4. Inaktivieren Sie die Markierung, indem Sie Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium mit 10 % hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS) bei RT bis zu 15 ml hinzufügen und einmal vorsichtig mischen. Stellen Sie sicher, dass das Pellet vorsichtig wieder aufgewirbelt wird, wenn sich ein Pellet gebildet hat.
5. Tube 5 min bei 328 x g und RT drehen.
6. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 5 ml phenolrotfreiem RPMI 1640-Medium mit 2 % FBS und 10 % Penicillin/Streptomycin (P/S) bei RT. Zählen Sie die Neutrophilen.
   Anmerkung: Ein Zellverlust von 50% kann nach der Markierung von rot fluoreszierenden Zellen auftreten.

>3. Induktion der Bildung extrazellulärer Fallen bei Neutrophilen

1. Eine Zellsuspension von 0,42 x 10⁶ Zellen/ml wird in phenolrotfreiem RPMI 1640-Medium hergestellt, das 2 % FBS und 10 % P/S enthält.
2. Geben Sie 37.500 Neutrophile in 90 μl pro Vertiefung in eine schwarze 96-Well-Platte mit flachem Boden.
3. Geben Sie 10 μl des gewählten Stimulus (z. B. Seren eines Patienten) in dreifacher Ausfertigung hinzu, um eine Konzentration von 10 % in der Vertiefung zu erreichen. Fügen Sie immer eine Negativkontrolle (Medium) in dreifacher Ausfertigung hinzu.
4. Inkubieren Sie im Dunkeln bei 37 °C für die gewünschte Zeit, die von 30 Minuten bis 2, 4 oder 6 Stunden reicht. Es wird empfohlen, 4 Stunden zu inkubieren.
5. Berechnen Sie das Volumen, das erforderlich ist, um 25 μl 5 μM undurchlässigen DNA-Farbstoff hinzuzufügen (siehe Materialtabelle), um eine Endkonzentration von 1 μM in der Vertiefung zu erreichen. Erforderlichenfalls eine Vorverdünnung in einem RPMI 1640-Medium mit 2 % FBS und 10 % P/S vornehmen, um eine Konzentration von 5 μM zu erhalten.
6. 15 Minuten vor Ende der Inkubationszeit 25 μl 5 μM undurchlässiger DNA-Farbstoff hinzufügen. Die Inkubation für weitere 15 min bei 37 °C im Dunkeln fortsetzen.
7. Entfernen Sie den Überstand (~125 μL) sehr vorsichtig und lagern Sie ihn bei Bedarf. 100 μl 4 % Paraformaldehyd (PFA) zugeben. Bleiben Sie im Dunkeln und fahren Sie sofort mit Schritt 4 fort.

>4. Extrazelluläre Fallen (NET) von Neutrophilen Visualisierung mit hochauflösender 3D-Immunfluoreszenz-Konfokalmikroskopie

1. Konfigurieren Sie die Einstellungen am konfokalen Immunfluoreszenzmikroskop, indem Sie auf die Aufnahmeeinrichtung klicken.
   1. Klicken Sie auf die Registerkarte Konfigurieren.
   2. Wählen Sie das Objektiv und die Kamera aus. Wählen Sie das 10X Apo Lambda Objektiv mit einem Erfassungsmodus einer konfokalen 60 μm Lochblende.
   3. Klicken Sie auf Platte und wählen Sie die 96-Well-Kunststoffplatte aus. Wählen Sie die zu besuchenden Websites und eine feste Anzahl von Websites aus. Füllen Sie 3 Spalten und 3 Reihen ohne Überlappung (0 μm) aus, die insgesamt 45 % der Vertiefung abdecken.
   4. Klicken Sie auf Akquise. Wählen Sie Laserbasierte Fokussierung aktivieren. Wählen Sie bei Bedarf Z-Reihe/Zeitreihe erfassen.
   5. Klicken Sie auf Site-Autofokus.
      1. Klicken Sie auf Fokus auf Plattenunterseite | Versatz um Bodendicke. Für die erste Vertiefung, um die Probe zu finden, wählen Sie die erste Vertiefung aus, die Sie erworben haben. Wählen Sie für den Site-Autofokus All Sites aus.
   6. Klicken Sie auf Wellenlängen.
      1. Wählen Sie für die Anzahl der Wellenlängen 2 aus. Wählen Sie für die Verfeinerungsstufe der TL-Schattierungskorrektur die Option 2 aus.
      2. Wählen Sie für Wellenlänge 1 die Option Texas Red aus.
         1. Wählen Sie für die Autofokus-Optionen Laser mit Z-Versatz, Nach-Laser-Versatz 1,1 μm. Verwenden Sie den Z-Stapel mit einem benutzerdefinierten Bereich von 200-10.
      3. Wählen Sie für Wellenlänge 2 Fluorescein-Isothiocyanat (FITC).
         1. Wählen Sie für die Autofokus-Optionen den Laser mit einem Z-Versatz von w1 0 μm aus. Verwenden Sie den Z-Stapel mit einem benutzerdefinierten Bereich von 200-10.
         2. Wählen Sie für die Aufnahmeoptionen die Option Z-Serie und Maximum des 2D-Projektionsbilds aus. Wählen Sie für die Erfassungsoptionen Schattierungskorrektur | Aus.
   7. Wählen Sie Z Series aus. Wählen Sie die Anzahl der Schritte aus: 10. Wählen Sie die Schrittweite: 3 μm (Gesamtbereich beträgt 27 μm).
2. Legen Sie die Platte in die konfokale Immunfluoreszenzmikroskopie.
   1. Klicken Sie auf die Registerkarte Ausführen.
      1. Füllen Sie den Namen und die Beschreibung des Tellers aus und wählen Sie den Lagerort aus.
      2. Wählen Sie die Bohrlöcher aus, die erworben werden müssen.
3. Wählen Sie die Belichtungszeit für Texas Red und FITC.
4. Klicken Sie auf Platte erfassen, um die Erfassung zu starten, die ca. 1 h pro Platte dauert.

>5. Analyse der NET-Bildung

1. Verwenden Sie ein Bildverarbeitungsprogramm, das für die Analyse wissenschaftlicher mehrdimensionaler Bilder entwickelt wurde (siehe Materialtabelle), um die NET-Bildung zu analysieren.
2. Übertragen Sie die erfassten Bilddaten auf eine separate Festplatte.
3. Wählen Sie das Werkzeug zum Hinzufügen von Farben aus.
   1. Wählen Sie w1 und dann den Ordner auf der Festplatte aus, in dem die Daten gespeichert sind.
   2. Wählen Sie w2 und dann den Ordner auf der Festplatte aus, in dem die Daten gespeichert sind.
      Anmerkung: Verwenden Sie ein Standardmakro, das w1 im Dateinamen verwendet, um den Texas Red-Bildern rote Farbe hinzuzufügen, und w2, um den FITC-Bildern grüne Farbe hinzuzufügen.
4. Wählen Sie Analysemakro aus.
   1. Wählen Sie w1 aus, und wählen Sie den Schwellenwert (Intensitätsschwellenwert) aus, der in der Regel 10 beträgt. Wählen Sie den gewünschten Pixelwert aus (Größenschwelle, z. B. 100).
   2. Wählen Sie w2 aus, und wählen Sie den Schwellenwert (Intensitätsschwellenwert), der in der Regel 10 beträgt. Wählen Sie den gewünschten Pixelwert aus (Größenschwellenwert, z. B. 500).
   3. Wählen Sie das Ziel für die Tabellenkalkulationsdatei aus, führen Sie die Analyse aus und speichern Sie anschließend die Protokolldateien.
5. Analysieren Sie Daten in einer Tabelle.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Aqua Steril H2O	B. Braun, Melsungen, Deutschland	12604052
Fötales Rinderserum (FBS)	Bodinco, Alkmaar, Niederlande		In hohen Konzentrationen eingesetzt, kann es die Bildung von NET-Netzwerken beeinflussen
Ficoll 5,7% - Amidotrizoat 9% Dichte 1.077 g/mL	LUMC, Leiden, Niederlande	97902861
Konfokales Immunfluoreszenzmikroskop	Image Xpress Micro Confocal (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)
Neutralisation PBS (10x)	Gibco, Paisley, Großbritannien	Tel.: 70011-036
Penicillin / Streptomycin (p/s)	Gibco, Paisley, Großbritannien	15070063
Phenolrotfrei RPMI 1640 (1x)	Gibco, Paisley, Großbritannien	Artikel-Nr.: 11835-063	Phenolrot kann das Immunfluoreszenzsignal stören
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	B. Braun, Melsungen, Deutschland	174628062
PKH26 2 μM Rot fluoreszierender Zelllinker	Sigma Aldrich Saint-Louis, MO, Vereinigte Staaten Von Amerika	PKH26GL-1KT	PKH sind patentierte Fluoreszenzfarbstoffe und eine Zellmarkierungstechnologie, die nach ihrem Entdecker Paul Karl Horan benannt
Programm zur wissenschaftlichen mehrdimensionalen Bildanalyse	ImageJ, Abteilung für Forschungsdienste, Nationales Institut für psychische Gesundheit, Bethesda, Maryland, USA
RPMI mittel 1640 (1x)	Gibco, Paisley, Großbritannien	Artikel-Nr.: 52400-025
Sytox grün 5 mM Undurchlässiger DNA-Farbstoff	Gibco, Paisley, Großbritannien	Artikel-Nr.: 57020
Trypanblauer Fleck 0,4%	Sigma Aldrich, Deutschland	17942E
96-Well, schwarze, mit Gewebekulturen behandelte Platte mit flachem Boden	Falke, NY, Vereinigte Staaten Von Amerika	353219