Isolierung von Lipiden aus Neutrophilen aus menschlichem Blut durch biphasische Trennung

Zusammenfassung

Quelle: Brogden, G., et al. Methoden zur Untersuchung von Lipidveränderungen bei Neutrophilen und der anschließenden Bildung von extrazellulären Neutrophilenfallen. J. Vis. Exp. (2017)

Dieses Video demonstriert die Lipidisolierung aus menschlichen Neutrophilen durch ein zweiphasiges Lösungsmittelsystem unter Verwendung von Methanol und Chloroform.

Protokoll

>1. Lipidisolierung und Analyse von Neutrophilen aus menschlichem Blut

1. Nehmen Sie Neutrophile und legen Sie sie auf Eis.
2. Pipettieren Sie auf dem Eis die Neutrophilen (in Methanol und Chloroformlösung vorhanden) in ein 15-ml-Glasröhrchen mit Schraubverschluss und einer Polytetrafluorethylen (PTFE)-Dichtung und homogenisieren Sie sie durch Schütteln für 1 min. Verwenden Sie Glasröhrchen, um zu verhindern, dass die Lipide an Kunststoffoberflächen binden. Verwenden Sie PTFE-Kappen, um eine Kontamination durch Gummi/Kunststoff zu verhindern.
3. Fügen Sie 2 ml Methanol hinzu, gefolgt von 1 ml Chloroform. Nochmals 1 Min. schütteln.
4. Drehen Sie die Glasröhren 30 Minuten lang bei RT und 50 U/min.
5. Pelletieren Sie die Proteinfraktion, indem Sie die Lösung bei 7 °C und 1.952 x g für 10 min zentrifugieren.
6. Dekantieren Sie den Überstand vorsichtig in ein neues 15-ml-Glasröhrchen mit Schraubverschluss, wobei das proteinhaltige Pellet zurückbleibt. Lagern Sie das Pellet bei -20 °C für eine spätere Quantifizierung.
7. Fügen Sie 1 ml Chloroform hinzu, warten Sie 1 min, fügen Sie 1 ml doppelt destilliertes Wasser hinzu und drehen Sie das Glasröhrchen mit dem Schraubverschluss mit der Probe für 30 s um.
8. Bei 7 °C und 1.952 x g für 10 min zentrifugieren und die obere Phase bis zur trüben Schicht verwerfen, aber nicht einschließend.
9. Falls erforderlich, führen Sie optional einen weiteren Reinigungsschritt durch, indem Sie Schritt 1.1.8 wiederholen.
10. Trocknen Sie die Proben in einem Vakuumkonzentrator bei 60 °C und lagern Sie sie bis zur Verwendung bei -20 °C.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
10 μl Spritze	Hamilton	701 NR 10 μl
Kanüle 26G	Braun	4657683
Chloroform	Carl Roth	7331.1
Methanol	Carl Roth	7342.1
Wasser	Carl Roth	3255,1	Frei von Endotoxinen

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